学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

IRF-1乙酰化调控亚溶解型C5b-9复合物诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡病变的机制研究

作　者: 周建博
导　师: 王迎伟
学　校: 南京医科大学
专　业: 微生物学
关键词: 亚溶解型C5b-9（sublytic C5b-9）肾小球系膜细胞（GMC） X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子（XAF1）细胞凋亡 sublytic C5b-9 GMC 干扰素调节因子1（IRF-1） XAF1 启动子活性 cAMP 反应元件结合蛋白（CBP） p300 IRF-1 乙酰化
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 30次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

第一部分研究XAF1基因表达在sublytic C5b-9诱导大鼠GMC凋亡中的作用目的：检查亚溶解型C5b-9（sublytic C5b-9）复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells, GMC）后对其X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1（X-linked inhibitor of apoptosis associated factor1, XAF1）表达的影响，并探讨XAF1基因表达在sublytic C5b-9诱导大鼠GMC凋亡中的作用。方法：首先通过Western blot检查sublytic C5b-9刺激不同时间的GMC中XAF1蛋白的表达情况，并测定不同分组处理的GMC中XAF1蛋白的表达水平。然后，构建XAF1真核表达质粒（pEGFP-N1/XAF1）和XAF1发夹状小干涉RNA（shorthairpin RNA, shRNA）表达质粒，并将上述质粒分别转染入GMC，其中XAF1shRNA（shXAF1）转染48h后再给予sublytic C5b-9刺激6h，用Western blot方法检查各组GMC中XAF1蛋白的表达情况，并通过流式细胞术测定GMC的凋亡数量。结果：Sublytic C5b-9刺激GMC后可明显上调XAF1蛋白的表达（刺激后6h达到高峰）。pEGFP-N1/XAF1质粒转染GMC能显著上调XAF1蛋白的表达，并明显增加GMC的凋亡数量。而shXAF1质粒的转染可明显下调sublytic C5b-9刺激GMC诱导的XAF1蛋白的表达，并有效抑制sublytic C5b-9引发的GMC凋亡。结论：Sublytic C5b-9刺激大鼠GMC后可通过上调XAF1基因的表达促进GMC的凋亡病变。第二部分探讨sublytic C5b-9诱导上调的IRF-1对大鼠GMC表达XAF1基因的调控作用及其机制目的：研究sublytic C5b-9刺激大鼠GMC后诱导上调的干扰素调节因子1（interferon regulatory factor1, IRF-1）对XAF1基因转录的调控作用及其机制，并进一步探讨IRF-1表达对sublytic C5b-9刺激诱导的GMC凋亡的影响。方法：采用PCR技术，扩增出大鼠XAF1基因启动子全长序列（-1490~+157nt），并将其插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中，得到pGL3-XAF1报告质粒。随后将pGL3-XAF1分别与IRF-1真核表达载体（pcDNA3.1/IRF-1）或IRF-1shRNA（shIRF-1）共转染GMC，再用sublytic C5b-9刺激6h，测定不同处理组的GMC中其相应的荧光素酶活性。同时，应用生物信息学软件（TFsearch）预测XAF1基因启动子上IRF-1可能的结合位点，并据此构建XAF1基因启动子截断的荧光素酶报告质粒（即pGL3-XAF1-1、pGL3-XAF1-2、pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4）。将上述XAF1基因启动子全长和各截断的荧光素酶报告质粒和pcDNA3.1/IRF-1共转染GMC，再行荧光素酶活性测定，筛选IRF-1的结合区域。之后，针对此区域IRF-1可能的结合位点设计引物，通过染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）实验进一步确证XAF1启动子区IRF-1的结合位点。此外，将pcDNA3.1/IRF-1和shIRF-1分别转染GMC，48h后再给予sublytic C5b-9刺激6h，通过Western blot检测各组GMC中XAF1蛋白的表达，并用流式细胞术检测GMC的凋亡情况。结果：pcDNA3.1/IRF-1载体转染GMC后可显著增强XAF1基因启动子活性，而shIRF-1能明显抑制由sublytic C5b-9刺激GMC诱导的XAF1基因启动子活性的上调。进一步的XAF1基因启动子截断和ChIP实验结果均表明，在大鼠XAF1基因启动子的-337~-47nt区域存在IRF-1的结合位点。再者，pcDNA3.1/IRF-1载体转染GMC能显著上调XAF1蛋白的表达，并使GMC的凋亡率显著增加。而用shIRF-1处理GMC后则能明显抑制由sublytic C5b-9刺激诱导的XAF1蛋白的表达以及GMC的凋亡反应。结论：Sublytic C5b-9刺激大鼠GMC后诱导上调的IRF-1可启动XAF1基因的转录，进而促进GMC的凋亡反应。第三部分：研究CBP/p300 乙酰化修饰IRF-1对sublytic C5b-9诱导GMC表达XAF1基因及GMC凋亡的调控作用目的：探讨sublytic C5b-9刺激GMC诱导的cAMP反应元件结合蛋白（cAMPresponse element-binding protein, CBP）和它的同源物p300与IRF-1结合及其对IRF-1的乙酰化修饰，并进一步研究XAF1的表达和GMC的凋亡情况。方法：首先通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）实验检查sublyticC5b-9刺激GMC所诱导的CBP/p300与IRF-1结合以及IRF-1的乙酰化情况。此外，通过将p300shRNA（shp300）转染入GMC沉默p300基因的表达后，再用Western blot检查其对sublytic C5b-9诱导的GMC中IRF-1、XAF1基因表达的影响，并通过Co-IP实验检查对IRF-1乙酰化的影响，同时用流式细胞术测定GMC的凋亡情况。结果：Sublytic C5b-9刺激GMC能够诱导p300与IRF-1结合以及上调IRF-1乙酰化水平，而沉默p300基因可明显抑制由Sublytic C5b-9诱导的IRF-1蛋白的乙酰化修饰、XAF1蛋白的表达及GMC的凋亡反应。结论：Sublytic C5b-9刺激GMC后诱导表达的p300能促进IRF-1的乙酰化，而此乙酰化修饰可显著增强IRF-1与XAF1基因启动子区的结合，从而促进XAF1基因的转录和GMC的凋亡。

全文目录

英文缩略词  6-8
中文摘要  8-12
ABSTRACT  12-16
第一部分：研究 XAF1 基因表达在 sublytic C5b-9 诱导大鼠 GMC凋亡中的作用  16-45
  前言  16-18
  材料和方法  18-30
  结果  30-39
  讨论  39-41
  参考文献  41-45
第二部分：探讨 sublytic C5b-9 诱导上调的 IRF-1 对大鼠 GMC表达 XAF1 基因的调控作用及其机制  45-68
  前言  45-46
  材料和方法  46-56
  结果  56-63
  讨论  63-65
  参考文献  65-68
第三部分：p300 乙酰化修饰 IRF-1 对 sublytic C5b-9 诱导 GMC表达 XAF1 基因及 GMC 凋亡的调控作用  68-83
  前言  68-69
  材料和方法  69-73
  结果  73-79
  讨论  79-81
  参考文献  81-83
结论  83-84
附录一综述：XAF1 基因表达、功能调控及作用机制与细胞凋亡的研究进展  84-96
  参考文献  89-96
附录二硕士在读期间发表的学术论文  96-97
致谢  97

IRF-1乙酰化调控亚溶解型C5b-9复合物诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡病变的机制研究

内容摘要

全文目录

相似论文