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转录因子Sp1调控人NDRG2转录机制研究

作　者: 曲璇
导　师: 刘新平；张健
学　校: 第四军医大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: NDRG2 Sp1 转录调控 启动子活性
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


Dynan WS等人于1983最早发现了转录因子——Specificity protein 1(Sp1)。Sp1主要特征是含有高度保守的DNA结合区,即羧基端存在3个Cys2His2锌指结构。Sp1是通过其羧基端的锌指结构与下游靶基因富含GC的序列结合。NDRG1(N-Myc down-regulated gene 1)作为NDRG家族最先报道的成员,在N-Myc敲除的小鼠胚胎中表达异常增加,所以被命名为N-Myc下游基因1。人NDRG2基因是我室在1999年利用基于PCR消减杂交技术进行神经胶质瘤与正常脑组织的基因表达差异研究时发现的一个在多数肿瘤组织中表达低的新基因【GenBank登录号AF159092】。NDRG2定位于染色体14q11.2,全长2024bp,含有16个外显子,15个内含子,编码一个含有357个氨基酸残基、分子量约41KDa的蛋白质。由于该基因在氨基酸序列上与已发现的N-Myc下游基因NDRG1(N-myc down-stream regulated gene 1)具有60%同源性,故将其命名NDRG2。通过生物信息学分析,我们发现人NDRG2启动子中含有两个髓样锌指蛋白1(myeloid zinc finger 1,MZF-1)的潜在结合位点和四个Sp1的潜在结合位点。为了研究Sp1和MZF-1与人NDRG2启动子的关系,分别将人NDRG2启动子pGL3-NDRG2(-1455——+274)和MZF-1过表达载体pcDNA3-MZF-1或Sp1过表达载体pcDNA3- Sp1共转染HEK293细胞和Hela细胞。荧光素酶报告基因分析Sp1促进人NDRG2启动子的活性3——4倍,而MZF-1却无法改变人NDRG2启动子活性。接下来,我们进一步构建Sp1干涉载体pSilencer-Sp1,分别应用RT-PCR和Western blot方法检测结果显示Sp1干涉载体pSilencer-Sp1明显下调Sp1的mRNA水平和蛋白质水平表达。我们分别将人NDRG2启动子pGL3-NDRG2(-1455——+274)载体与Sp1显性负突变载体PEBGN-Sp1或Sp1的干涉载体pSilencer-Sp1共转染HEK293细胞和Hela细胞。荧光素酶报告基因分析,Sp1显性负突变体PEBGN-Sp1和Sp1干涉载体pSilencer-Sp1明显抑制人NDRG2启动子的活性。为了明确Sp1是否与人NDRG2启动子pGL3-NDRG2(-1455——+274)结合,我们将一系列不同人NDRG2启动子的截短体与阴性对照载体pcDNA3或Sp1过表达载体pcDNA3- Sp1共转染HEK293细胞。结果显示Sp1可能与人NDRG2启动子中三个富含GC的区域结合,分别为人NDRG2启动子A:NDRG2(-148——-138)、B:NDRG2(+15——+19)、C:NDRG2(+29——+33)。接下来,我们通过PCR的方法构建了一系列Sp1结合位点突变的人NDRG2启动子的载体——M1(A点突变)、M2(B点突变)、M3(C点突变)、M12(AB点突变)、M13(AC点突变)和M23(BC点突变)。荧光素酶报告基因分析,单个Sp1结合位点突变体M1、M2和M3相对于野生型的启动子活性均有不同程度的降低。两个Sp1结合位点突变载体M12、M13和M23相对于野生型的启动子活性至少降低约50%。但是以上结果都无法证明Sp1是如何调控人NDRG2启动子,为了进一步研究Sp1是否与人NDRG2启动子直接结合?我们通过体内实验染色体免疫共沉淀(ChIP)和体外实验凝胶迁移实验(EMSA),进一步实验证实了Sp1与人NDRG2启动子(-148——-138)直接结合。综上所述,我们发现NDRG2是Sp1转录调控的一个新的靶基因。Sp1对NDRG2转录调控的新认识,不仅丰富了Sp1的信号转导通路,而且为进一步明确NDRG2的功能、为NDRG2在肿瘤治疗中的应用提供了新的线索和实验依据。

全文目录


缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
前言  13-14
文献回顾  14-25
正文  25-47
  实验一 （转录因子SP1 和MZF-1 对人NDRG2 启动子的调控）  25-35
    1 材料  25-26
    2 方法  26-29
    3 结果  29-34
    4 讨论  34-35
  实验二 （转录因子SP1 与人NDRG2 启动子结合位点分析）  35-47
    1 材料  35-36
    2 方法  36-42
    3 结果  42-46
    4 讨论  46-47
小结  47-48
参考文献  48-62
个人简历和研究成果  62-63
致谢  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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