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转IRF-1基因牛胎儿成纤维细胞的BVDV及IBRV抗性研究
作 者: 齐巍巍
导 师: 王锋
学 校: 南京农业大学
专 业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 胎儿成纤维细胞 牛 IRF-1 转基因 BVDV IBRV 抗病毒
分类号: S823
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
干扰素调节因子1(Interferon regulatory factor-1, IRF-1),是干扰素调节因子家族成员之一,可以激活I类干扰素基因的转录,被证明有调节细胞增殖、凋亡、免疫等多方面的生物学功能。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)为单链RNA病毒,主要引起牛病毒性腹泻,并且可感染多种偶蹄类动物;牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)为双链DNA病毒,主要感染牛,引起牛呼吸道疾病、结膜病、生殖道疾病多种疾病。这两种病毒引起的疾病没有行之有效的治疗方法,给我国畜牧业造成了巨大损失,我国进出境牛及其产品大多有对这两种疫病检疫的要求。为研究转IRF-1基因细胞对BVDV和IBRV的抗性,进一步为生产抗病转基因家畜奠定基础,本研究制备了牛胎儿成纤维细胞,将携带IRF-1基因的pIRES2-EGFP-IRF-1载体通过转基因的方法转染牛胎儿成纤维细胞,获得了瞬时表达IRF-1基因的转基因细胞,然后用BVDV和IBRV作用于转基因细胞,对IRF-1的相关抗性进行了研究。研究内容包括:(1)建立了瞬时表达IRF-1基因的转基因细胞。采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到牛胎儿成纤维细胞。然后利用新型脂质体FuGENE(?) HD将携带IRF-1基因的pIRES2-EGFP-IRF-1载体转染牛胎儿成纤维细胞,利用流式细胞仪分选法研究了FuGENE(?) HD与DNA比例对转基因效率的影响,并利用PCR对转基因细胞进行了鉴定。最后使用MTT法研究了转基因细胞和非转基因细胞的生长曲线,流式细胞仪分析了两种细胞的凋亡情况,并使用荧光定量PCR研究了转基因细胞和非转基因细胞中IRF-1基因的表达水平。结果显示:分离得到的牛胎儿成纤维细胞,细胞形态为梭形,呈漩涡状生长;FuGENE(?) HD与DNA的比例为8:2(μL:μg)转染效率最高,为11.27%;PCR鉴定获得的细胞为转基因细胞;牛胎儿成纤维细胞的生长呈“潜伏期-对数期-平台期”的生长模式,转基因细胞生长速度较慢;转基因细胞的凋亡率为9.6%±0.44,较对照组细胞显著提高(P<0.05);荧光定量PCR检测转基因细胞中目的基因的表达量显著高于对照组细胞(P<0.05)。(2)研究了BVDV对转基因细胞和对照细胞生物学特性的影响。使用MDBK细胞获得了病变情况良好的BVDV,然后利用标准滴度的病毒液作用于转基因细胞和对照细胞,分析了病毒在两种细胞中的滴度,病毒作用后细胞的生长曲线,细胞的凋亡情况。结果显示:病毒在对照细胞和转基因细胞中的滴度分别为10-6.4/0.1 mL、10-5.6/0.1mL,差异显著;病毒作用后细胞生长曲线均呈现下降的趋势,但转基因细胞的生长曲线呈先升高后降低的趋势;非转基因细胞在72 h的凋亡率高于转基因细胞的凋亡率,且差异极显著。这些结果说明IRF-1具有良好的抵抗BVDV作用的生物学功能。(3)研究了IBRV对转基因细胞和对照细胞生物学特性的影响。使用MDBK细胞获得了病变情况良好的IBRV,然后利用500 TCIDso滴度的病毒液作用于转基因细胞和对照细胞,分析了病毒在两种细胞中的滴度,病毒作用后细胞的生长曲线,细胞的凋亡情况。结果显示:病毒在对照细胞和转基因细胞中的滴度分别为10-6/0.1 mL、10-5.8/0.1mL,差异不显著;病毒作用后细胞生长曲线均呈现下降的趋势,差异不显著;非转基因细胞在72 h的凋亡率高于转基因细胞的凋亡率,且差异极显著。IBRV作用后转基因细胞与对照组形态无显著差异,而凋亡率显著降低,因此,本研究推测IRF-1对少量的IBRV具有抵抗作用。
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全文目录
摘要 7-9ABSTRACT 9-11第一部分 文献综述 11-29 第一章 IRF-1的研究进展 11-21 1 干扰素概述 11 2 干扰素调节因子家族 11-12 3 IRF-1的结构和生物学作用 12-18 3.1 IRF-1结构特征 12-13 3.2 IRF-1的生物学作用 13-18 4 研究展望 18-19 参考文献 19-21 第二章 BVDV和IBRV研究进展 21-29 1 牛病毒性腹泻病毒研究进展 21-23 1.1 BVDV简介 21 1.2 BVDV形态、理化特性及生物学特性 21-22 1.3 流行病学 22-23 1.4 防控 23 2 牛传染性鼻气管炎病毒研究进展 23-26 2.1 IBRV简介 23-24 2.2 IBRV形态、理化特性及生物学特性 24 2.3 IBRV的基因组及编码蛋白 24-25 2.4 流行病学 25 2.5 防治 25-26 参考文献 26-29第二部分 试验研究部分 29-63 第三章 转IRF-1基因牛胎儿成纤维细胞的制备 29-43 1 材料与方法 30-36 1.1 试验材料 30-31 1.2 试验方法 31-36 2 结果 36-40 2.1 成纤维细胞分离培养结果 36-37 2.2 质粒DNA提取、鉴定结果 37 2.3 体细胞转染效率的优化与转基因细胞的鉴定 37-38 2.4 转基因细胞和非转基因细胞增殖活性 38 2.5 基因转染对细胞凋亡情况的影响 38-39 2.6 转基因细胞和非转基因细胞中IRF-1基因的表达水平 39-40 3 讨论 40-42 参考文献 42-43 第四章 转IRF-1基因牛胎儿成纤维细胞的BVDV抗性研究 43-55 1. 材料与方法 44-47 1.1 试验材料 44-45 1.2 试验方法 45-47 2 结果 47-51 2.1 MDBK细胞及其病变 47-48 2.2 BVDV在MDBK、正常细胞和转基因细胞中TCID_(50)的测定 48-49 2.3 BVDV对转基因细胞和非转基因细形态的影响 49 2.4 BVDV对转基因细胞和非转基因细胞增殖活性的影响 49-50 2.5 BVDV对转基因细胞和非转基因细胞凋亡情况的影响 50-51 3 讨论 51-53 参考文献 53-55 第五章 转IRF-1基因牛胎儿成纤维细胞的IBRV抗性研究 55-63 1. 材料与方法 56 1.1 试验材料 56 1.2 试验方法 56 2 结果 56-60 2.1 MDBK细胞及其病变 56-57 2.2 IBRV在MDBK、正常细胞、转基因细胞TCID_(50)的测定 57-58 2.3 IBRV对转基因细胞和非转基因细胞形态的影响 58-59 2.4 IBRV对转基因细胞和非转基因细胞增殖活性的影响 59 2.5 IBRV对转基因细胞和非转基因细胞凋亡情况的影响 59-60 3 讨论 60-62 参考文献 62-63全文结论 63-65攻读硕士期间发表的论文 65-67致谢 67
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛
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