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PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞钙信号的影响及其机理初探

作 者: 代蕾
导 师: 张书霞
学 校: 南京农业大学
专 业: 基础兽医学
关键词: 猪圆环病毒Ⅱ型 淋巴细胞 细胞凋亡 细胞内钙离子浓度
分类号: S858.28
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease, PCVD)主要是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2, PCV2)引起的猪传染性疾病。由于PCV2能致感染仔猪的免疫抑制,给全世界养猪业带来了巨大的损失。2008年第20届国际猪病大会上,人们已将PCVD列为当前危害养猪业发展的头号疾病。PCV2感染的主要特征是外周血和免疫器官淋巴细胞的大量缺失及单核细胞浸润,也是其致感染仔猪免疫抑制的基础。有的研究表明免疫抑制是由于淋巴细胞凋亡引起的。本实验在我们课题组以前研究的基础上,通过体外实验,研究PCV2在对体外培养仔猪淋巴细胞凋亡过程中钙信号的作用,并初步探讨胞内钙离子浓度([Ca2+]i)升高的机制。PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞凋亡和钙信号的影响:5头经ELISA检测PCV2抗体阴性的35日龄断奶仔猪,无菌采集脾脏,分离脾脏细胞,分为对照组和攻毒组进行体外培养。攻毒组接种PCV2,并分别于培养后0 h、6 h、12 h、24 h收取淋巴细胞。用流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI法检测不同时间点淋巴细胞凋亡率;荧光分光光度法检测负载了钙荧光探针(Fura-2/AM)的淋巴细胞[Ca2+]i;采用Western-blot方法检测细胞内CaM和CaMKII蛋白表达量。结果:PCV2组淋巴细胞凋亡率高于对照组,并且在12h时差异显著(P<0.05);[Ca2+]i随培养时间呈上升趋势,并且PCV2组在培养12h和24h时显著高于对照组(P<0.05);CaM蛋白的表达量随培养时间有升高趋势,在培养12h时PCV2组显著高于对照组(P<0.05);CaMKII蛋白表达量在所有时间变化不大。表明PCV2诱导体外培养仔猪淋巴细胞凋亡与胞内Ca2+信号有关。PCV2影响体外培养仔猪淋巴细胞钙信号机理初探:目前研究认为,细胞内钙稳态主要是通过内质网保持的,内质网上有3种与Ca2+摄取和释放相关的通道:向胞浆内释放Ca2+的兰尼啶受体(RyR)和1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)以及将Ca2+转运至内质网中的钙泵(Ca2+-ATPase).本试验主要测定PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞IP3R、RyR、Ca2+-ATPase2、Ca2+-ATPase4 mRNA转录变化,初步探讨PCV2致[Ca2+]i升高的机理。体外培养的仔猪脾脏淋巴细胞,分为PCV2组和对照组,分别在培养后0 h、6 h、12 h、24 h收集细胞,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测IP3R-2、RyR-1、Ca2+-ATPase2、Ca2+-ATPase4 mRNA转录量变化。结果:IP3R-2mRNA的转录量在培养12 h后PCV2组显著高于对照组(P<0.05),RyR-1mRNA转录量变化不明显,Ca2+-ATPase2mRNA转录量在培养6 h和12 h后上升且PCV2组显著高于对照组(P<0.05)、Ca2+-ATPase4的mRNA转录量在培养6 h和12 h后上升且对照组显著高于PCV2组(P<0.05)。结论:PCV2可以通过上调IP3R mRNA转录和下调Ca2+-ATPase4 mRNA转录引起淋巴细胞内Ca2+超载。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11部分缩写的中英文对照  11-12第一篇 文献综述  12-25  第一章 猪圆环病毒2型与钙信号通路  13-25    1. PCV2与免疫抑制  13-15      1.1. PCV2概述  13-14      1.2. PCV2对免疫的影响  14-15      1.3. 免疫抑制与细胞凋亡  15    2. 细胞凋亡与细胞内钙离子  15-19      2.1. Ca~(2+)与线粒体通路的细胞凋亡  16      2.2. Ca~(2+)与内质网通路的细胞凋亡  16-18      2.3. 核钙信号与细胞凋亡调节  18      2.4. Bcl-2家族调节Ca~(2+)机制  18-19      2.5. 活性氧调节Ca~(2+)机制  19    3. 细胞内钙离子通道  19-21      3.1. 细胞膜电压依赖性和受体操控性Ca~(2+)通道  19-20      3.2. 细胞质膜Ca~(2+)泵  20      3.3. IP_3R和RyR通道  20-21    4. 钙调素与钙/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ  21-23      4.1. 钙调素  21-22      4.2. 钙/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ  22-23    5. 实验目的与意义  23-25第二篇 实验研究  25-59  第二章 PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞凋亡和钙信号的影响  27-41    1. 材料和方法  29-35      1.1. 试验动物  29      1.2. 病毒  29      1.3. 主要仪器  29      1.4. 主要试剂  29-31      1.5. 仔猪脾脏细胞的制备和培养  31-32      1.6. 实验方法  32-35      1.7. 统计学处理  35    2. 结果与分析  35-39      2.1. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞凋亡率的影响  35-36      2.2. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞[Ca2+]i荧光强度的影响  36      2.3. PCV2对淋巴细胞内CaM蛋白表达量的影响  36-38      2.4. PCV2对淋巴细胞内CaMKⅡ表达的影响  38-39    3. 讨论  39-41  第三章 PCV2影响体外培养仔猪淋巴细胞钙信号的机理初探  41-59    1. 材料和方法  43-48      1.1. 病毒  43      1.2. 主要试剂  43      1.3. 主要仪器  43-44      1.4. 实验动物及处理  44      1.5. 实验方法  44-48      1.6. 数据统计  48    2. 结果  48-56      2.1. 荧光定量PCR标准曲线的建立及其扩增曲线  48-53      2.2. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞IP3R-2 mRNA转录水平的影响  53-54      2.3. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞RyR-1基因转录的影响  54      2.4. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞Ca~(2+)-ATPase2型基因转录影响  54-55      2.5. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞Ca~(2+)-ATPase4型基因转录影响  55-56    3. 讨论  56-59      3.1. PCV2可通过上调体外培养仔猪淋巴细胞内IP3R-2基因mRNA转录升高[Ca~(2+)]i  56-57      3.2. PCV2可通过下调Ca~(2+)-ATPase酶4型基因转录维持淋巴细胞胞浆内高浓度钙  57-59参考文献  59-69全文总结  69-71致谢  71

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 >
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