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脱氧雪腐镰刀菌烯醇对鸡软骨细胞增殖、分化及凋亡的影响

作　者: 戴玉奕
导　师: 侯加法
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 鸡软骨细胞 凋亡 基因表达
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON),又名呕吐毒素(vomitoxin),是由镰刀菌属病原真菌产生的真菌毒素之一。研究报道DON具有很强的细胞毒性,对于原核细胞、真核细胞均具有明显的毒性作用,DON可抑制DNA、RNA和蛋白质的合成,并诱导细胞凋亡。本试验选用鸡软骨细胞为研究对象,观察体外培养的鸡软骨细胞的形态学特征；在DON不同浓度梯度作用和不同培养时间作用下,观察DON对鸡软骨细胞增殖和分化的影响；研究DON对鸡软骨细胞凋亡的相关凋亡因子Caspase-3、C-myc和P53 mRNA的表达的影响,为深入研究DON的细胞毒性分子机制提供依据。试验I鸡软骨细胞的体外培养及DON对体外培养的鸡软骨细胞增殖与分化的影响目的：探讨17如龄鸡胚软骨细胞体外培养生长规律及DON对其增殖与分化的影响。方法：设计以1 mg·mL-1的Ⅳ型胶原酶进行消化,分离制备软骨细胞,透射电子显微镜和倒置相差显微镜下观察体外培养条件下软骨细胞的生物学特性及生长状况。添加不同浓度的DON,通过MTT法测定细胞增殖率,PNPP法测定软骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性,倒置显微镜下观察软骨细胞形态的变化。结果：(1)透射电子显微镜下可观察到软骨细胞的生物学特征,倒置相差显微镜下可观察到软骨细胞生长状况；(2)与对照组相比,10、5、2、1、0.5、0.1、0.02μg·mL-1的DON均显著抑制软骨细胞增殖(P<0.01)；(3)与对照组相比,20、80、320 ng·mL-1DON极显著抑制软骨细胞ALP活性(P<0.01)；(4)倒置显微镜下发现软骨形态发生变化。结论：鸡软骨细胞培养成功为下一步研究提供了试验材料；DON能显著抑制软骨细胞的增殖与分化。试验II DON对鸡软骨细胞凋亡和氧化应激的影响目的：在建立鸡软骨细胞体外培养方法的基础上,研究DON对鸡软骨细胞凋亡和氧化应激的影响。方法：以320 ng·mL-1DON添加到培养基中进行培养,流式细胞术检测其凋亡情况。取软骨细胞原代接种于六孔板,添加含5%FBS的DMEM/F12对照组和含不同浓度的DON试验组,48 h后分别用试剂盒测定鸡软骨细胞GSH、LDH、SOD活性。结果：(1)流式检测凋亡率升高；(2)与对照组相比,20、80、320ng·mL-1DON均可使细胞培养液中GSH、LDH、SOD含量升高。结论：DON促进软骨细胞凋亡。试验ⅢI DON对鸡软骨细胞凋亡相关基因表达的影响目的：在建立鸡软骨细胞体外培养方法的基础上,研究DON对Caspase-3、C-myc和P53 mRNA表达的影响。方法：用含20、80、320 ng·mL-1的DON以及含5%FBS的DMEM/F12对照组处理鸡软骨细胞48 h后,用RT-PCR方法检测其Caspase-3、C-myc和P53 mRNA表达量变化。结果：与对照组相比,20、80、320 ng·mL-1DON可显著上调Caspase-3 mRNA的表达(P<0.01);80、320 ng·mL-1DON作用下C-myc的表达出现明显上升(P<0.01);320 ng·mL-1DON可显著上调P53 mRNA表达(P<0.01)。结论：DON可能上调Caspase-3、P53和C-myc基因1mRNA表达量,激活细胞的线粒体途径,导致细胞凋亡。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-13符号及缩略语说明  13-14前言  14-15上篇 文献综述  15-43  第一章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒理学研究进展  15-29    1 DON的理化特性  15-16    2 DON的污染情况  16-17    3 DON的毒性作用  17-23      3.1 动物毒性  17-18      3.2 对人的毒性  18      3.3 细胞毒性  18-20      3.4 免疫毒性  20-21      3.5 联合毒性  21-23    参考文献  23-29  第二章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇与细胞凋亡研究进展  29-43    1 细胞凋亡  29-32      1.1 细胞凋亡的形态学检测  29-30      1.2 细胞凋亡的生化检测  30-32      1.3 细胞凋亡的相关因素  32    2 细胞凋亡的主要调控基因  32-37      2.1 细胞凋亡中的Caspase  32-34      2.2 C-myc基因  34-35      2.3 P53基因  35-37    3 DON与细胞凋亡  37-39    参考文献  39-43下篇 试验研究  43-81  第三章 鸡软骨细胞体外培养及DON对其细胞增殖与分化的影响  43-59    1 材料与方法  44-48      1.1 材料  44-45      1.2 方法  45-47      1.3 统计分析  47-48    2 结果  48-55      2.1 倒置显微镜观察观察软骨细胞生长状态  48-49      2.2 透射电子显微镜下观察软骨细胞生长状态  49-51      2.3 鸡软骨细胞增殖率的测定结果  51-53      2.4 碱性磷酸酶(ALP)活性的检测结果  53-54      2.5 DON对鸡软骨细胞形态的影响  54-55    3 讨论  55-56      3.1 软骨细胞体外分离与培养的方法  55      3.2 DON对鸡软骨细胞增殖和分化的影响  55-56    4 小结  56-57    参考文献  57-59  第四章 DON对鸡软骨细胞凋亡和氧化应激的影响  59-71    1 材料与方法  59-63      1.1 材料  59-60      1.2 方法  60-62      1.3 统计分析  62-63    2 结果  63-66      2.1 流式细胞仪检测  63-64      2.2 谷胱甘肽(GSH)的测定  64      2.3 乳酸脱氢酶(LDH)的测定  64-65      2.4 超氧化物歧化酶(SOD)的测定  65-66    3 讨论  66-68    4 小结  68-69    参考文献  69-71  第五章 DON对鸡软骨细胞凋亡相关基因表达的影响  71-81    1 材料和方法  71-75      1.1 材料  71-72      1.2 方法  72-74      1.3 统计分析  74-75    2 结果  75-76      2.1 RT-PCR结果  75-76    3 讨论  76-78    4 小结  78-79    参考文献  79-81全文总结  81-83论文创新之处  83-85致谢  85-87附录  87

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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