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西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究

作　者: 吴丽云
导　师: 高如承
学　校: 福建师范大学
专　业: 动物学
关键词: 西施舌超低温冷冻保存流式细胞术质膜完整性细胞凋亡线粒体功能超微结构
分类号: S968.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文采用流式细胞术和显微术的方法,研究流式细胞术用于评价西施舌(Coelomactra antiquata)精子质量的可行性、西施舌精子的超低温冷冻保存技术以及冷冻损伤机制,旨在建立一套成熟的西施舌精子超低温冷冻保存技术,为西施舌的人工育苗和遗传育种等研究提供科学依据和技术支持。主要研究结果如下：采用伊红拒染法和PI拒染法,借助光学显微镜和流式细胞仪进行两种方法的相关性研究和精密性比较,从而探讨流式细胞术用于评价西施舌冻融精子成活率的可行性。结果表明伊红拒染法和PI拒染法呈显著正相关(r=0.954,P=0.003),两种方法均能有效检测西施舌精子的成活率,且相关性很好,但是PI-流式细胞术的精密性(CV为2.39%)要优于伊红拒染法实验(CV为4.67%),故流式细胞术适用于西施舌精子成活率的检测。采用流式细胞术,以质膜完整率即成活率为精子质量评价指标,研究抗冻剂,预冻速率和冷冻速率对西施舌精子超低温冷冻保存的影响。以一定的降温程序进行西施舌精子的超低温保存,研究二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)和丙二醇(PG)三种抗冻剂分别在1%、2.5%、4%、5%、10%、15%和20%时对西施舌精子质膜完整性及成活率的影响,结果仅4%、10% DMSO,2.5%、5%、15% EG和20%PG被选出用于预冻速率和冷冻速率的筛选。预冻速率分析以下5个速率：①1℃/min;②4℃/min;③6℃/min;④8℃/min⑤20±1℃10min,采用4℃/min的预冻速率可获得最佳的超低温冷冻效果,被用于冷冻速率的筛选。冷冻速率设置5个梯度：①0.25℃/min；②0.5℃/min;③1℃/min;④4℃/min⑤直接投入液氮。35℃水浴解冻,流式细胞仪分析精子质膜完整性及成活率,以及进行人工受精验证,得出以15%EG为抗冻剂,4℃/min为预冻速率,4℃/min为冷冻速率,可获得最佳的成活率和受精率,分别为95.53%和52.32%。采用流式细胞术研究DMSO、EG和PG三种抗冻剂对西施舌冻融精子质膜完整性、细胞凋亡状况以及线粒体功能状态的影响,进而评价不同抗冻剂对西施舌冻融精子质量的影响,从而研究超低温冷冻保存对西施舌精子的冷冻损伤机理。结果表明,DMSO、EG、和PG三种抗冻剂对维持冻融精子的质膜完整性起到较好的作用,在一定程度上促进了冻融精子的凋亡进程,且不同抗冻剂及不同浓度的抗冻液对西施舌精子质膜完整性和细胞凋亡的影响不同,15% EG作为抗冻液,得到冻融精子的质膜完整率最高,早期凋亡率最低,分别为80.54%和7.99%；而且超低温冷冻保存过程降低了西施舌精子的线粒体活性,DMSO、EG和PG三种抗冻剂对维持西施舌冻精的线粒体活性起到了较好的保护作用,15%EG处理组的坏死精子比例最低,有线粒体功能的活性精子比例最高,分别为15.04%和81.32%。采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜分析比较超低温保存前后西施舌精子的外部形态和超微结构变化；并结合流式细胞术结果进行超低温冷冻损伤机理的研究。结果表明,扫描电镜下,西施舌冻融精子的顶体、线粒体损伤比较明显,精子头部表面呈不规则凹陷、鞭毛断裂甚至脱落等；透射电镜下西施舌冻融精子的质膜膨胀、破裂,顶体膜脱落、破裂。线粒体膜系统也受到破坏,线粒体解体、呈空泡状等。这些损伤表现与流式细胞术研究超低温冷冻保存对西施舌精子质膜完整性、细胞凋亡状态和线粒体功能的影响结果是相同的。由此可知,超低温冷冻保存过程造成了西施舌精子质膜、顶体、线粒体等处的不同程度的损伤。

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中文摘要 2-4Abstract 4-6中文文摘 6-10目录 10-13绪论 13-21 1. 课题背景 13-14 2. 海洋双壳类精子的超低温保存研究进展 14-16 2.1 冷冻保护剂的影响 14-15 2.2 冷冻速率的影响 15 2.3 降温平衡时间的影响 15-16 3. 冷冻损伤机理的研究进展 16-17 4. 流式细胞术在水生动物研究中的应用(已发表) 17-20 4.1 流式细胞术在细胞分类和分选中的应用 17-18 4.2 流式细胞术在细胞免疫功能与免疫机制研究上的应用 18 4.3 流式细胞术在细胞核DNA研究中的应用 18-19 4.4 流式细胞术在精子质量评价中的应用 19-20 5. 展望 20-21第一章西施舌精子冷冻保存研究 21-33 第一节两种检测西施舌精子活力方法的比较研究 21-25 1.1.1 前言 21 1.1.2 材料与方法 21-22 1.1.2.1 材料 21 1.1.2.2 方法 21-22 1.1.2.2.1 伊红拒染法 22 1.1.2.2.2 PI拒染法 22 1.1.3 结果 22-24 1.1.3.1 相关性研究 22-23 1.1.3.2 精密性研究 23-24 1.1.4 讨论 24-25 第二节西施舌精子冷冻保存研究 25-33 1.2.1 前言 25 1.2.2 材料和方法 25-26 1.2.2.1 材料 25 1.2.2.2 方法 25-26 1.2.2.2.1 探讨抗冻剂对精子成活率的影响 25 1.2.2.2.2 探讨预冻速率对精子成活率的影响 25-26 1.2.2.2.3 探讨冷冻速率对精子成活率的影响 26 1.2.2.2.4 人工受精评价冻精的质量 26 1.2.2.3 统计分析 26 1.2.3 结果与分析 26-31 1.2.3.1 抗冻剂对精子质膜完整性及成活率的影响 28-29 1.2.3.2 预冻速率对西施舌精子质膜完整性及成活率的影响 29 1.2.3.3 冷冻速率对西施舌精子质膜完整性及成活率的影响 29-30 1.2.3.4 人工受精评价冻精的质量 30-31 1.2.4 讨论 31-33 1.2.4.1 超低温冷冻保存对精子质量的影响 31 1.2.4.2 抗冻液对精子超低温保存的影响 31-32 1.2.4.3 预冻速率对精子超低温冷冻保存的影响 32 1.2.4.4 冷冻速率对精子超低温冷冻保存的影响 32-33第二章抗冻剂对西施舌精子质膜完整性、细胞凋亡和线粒体功能的影响研究 33-41 2.1 前言 33 2.2 材料与方法 33-34 2.2.1 材料 33 2.2.2 方法 33-34 2.2.2.1 探讨不同抗冻剂对西施舌精子成活率及凋亡状况的影响 33-34 2.2.2.2 探讨不同抗冻剂对西施舌精子线粒体功能的影响 34 2.3 结果与分析 34-37 2.3.1 不同抗冻剂对西施舌冻融精子成活率及凋亡状况的影响 34-35 2.3.2 不同抗冻剂对西施舌精子线粒体功能的影响 35-37 2.4 讨论 37-41第三章超低温保存前后西施舌精子的超微结构研究 41-49 3.1 前言 41 3.2 材料与方法 41-42 3.2.1 材料来源 41 3.2.2 精液冷冻 41 3.2.3 电镜样品制备 41-42 3.3 结果与分析 42 3.3.1 冷冻前西施舌精子的外部形态和超微结构 42 3.3.2 冷冻后精子外部形态和超微结构的变化 42 3.4 讨论 42-49第四章结论 49-51参考文献 51-61攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 61-63致谢 63-65个人简历 65-67

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