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β-catenin在猪卵巢组织中的表达以及对猪卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇生成酶的影响

作　者: 王莉
导　师: 徐银学
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪卵巢颗粒细胞 Wnt/β-catenin信号通路 RNAi 过表达 细胞凋亡 类固醇合成
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


以P-catenin为关键信号转导分子的Wnt信号转导通路在雌性发育过程中有重要作用,其表达缺失或者突变都会引起Wnt/β-catenin信号转导紊乱,从而对机体组织或细胞产生重要影响。敲除Wnt4可导致小鼠在出生前部分的性反转以及卵母细胞的衰竭,在敲除β-catenin的小鼠颗粒细胞中形成内含紊乱和多形性粒层细胞的卵泡样结构,可导致颗粒细胞癌的发生。近来发现,β-catenin参与了促性腺激素释放激素调控的转录网络,对激素生成有重要作用。本研究以二花脸、皮特兰、商品杂种猪的卵巢以及猪卵巢颗粒细胞为实验材料,利用real time RT-PCR检测了不同猪种卵巢内β-catenin以及不同生长时期卵泡与卵巢颗粒细胞、卵母细胞内β-catenin的表达水平；利用RNAi方法敲减β-catenin,同时利用LiCl拮抗GSK-3β对β-catenin的磷酸化、降解作用,使胞质内β-catenin含量积聚的原理,用LiCl持续处理颗粒细胞使之过表达。利用流式细胞术、real time RT-PCR、western blot等方法从沉默和过表达两个方面研究P-catenin基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡以及类固醇激素合成酶的影响。主要研究结果如下：1利用real time RT-PCR法检测不同品种猪卵巢以及不同生长时期猪卵泡及卵巢颗粒细胞、卵母细胞内Wnt/β-catenin信号通路关键信号转导分子β-catenin的表达情况,结果表明：β-catenin在不同品种猪卵巢中有差异表达,二花脸猪卵巢内的β-catenin表达量是普通商品猪卵巢的近3倍(p<0.05),而皮特兰猪巢内的β-catenin表达量只有普通商品猪卵巢的40%。β-catenin在卵泡的不同发育阶段有差异表达,大卵泡中β-catenin表达量显著高于中卵泡和小卵泡(p<0.05)。β-catenin在卵巢颗粒细胞和卵母细胞中亦有差异表达,颗粒细胞中β-catenin含量是卵母细胞中的近2.5倍(p<0.05)。2为了研究Wnt/β-catenin信号通路在猪卵泡颗粒细胞中的作用,本研究从猪卵巢卵泡(3-5mm)内分离颗粒细胞(pGCs)进行体外培养。基于P-catenin在该通路中的核心地位,分别采用RNAi技术“沉默”猪P-catenin基因,阻抑Wnt/β-catenin信号通路,LiCl处理激活Wnt/β-catenin信号通路以检测β-catenin对猪卵泡颗粒细胞凋亡和类固醇激素合成的影响。结果表明：(1)采用的RNAi技术成功地“敲减”猪β-catenin基因,在mRNA水平该基因被下调59.93%(p<0.05),蛋白水平被下调。建立了Wnt/β-catenin信号通路阻抑的细胞模型。敲减β-catenin显著增加细胞凋亡率,上调Bax的表达(32.76%,p<0.05),下调BCL-2的表达(44.28%,p<0.05),并下调P450arom mRNA的表达(47.72%,p<0.05),但不影响P450scc的表达。(2)LiCl处理成功激活Wnt/β-catenin通路,β-catenin在mRNA水平该基因被上调95.15%(p<0.05),蛋白水平被上调。建立了Wnt/β-catenin信号通路激活的细胞模型。过表达P-catenin显著增加细胞凋亡率下调Bax的表达(25.60%,p<0.05),上调BCL-2的表达(12.58%,p.>0.05),并上调P450arom mRNA(151.6%,p<0.05)和P450scc mRNA(124.3%,p<0.05)的表达。表明Wnt/β-catenin信号通路在猪卵泡颗粒细胞中有重要的调控作用。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11缩略语  11-12文献综述  12-26  1 β-catenin研究进展  12-14    1.1 Wnt/β-catenin信号通路的类型  12    1.2 经典Wnt/β-catenin的分子作用机制  12-14    1.3 β-catenin蛋白的结构与功能  14  2 Wnt/β-catenin在卵巢发育过程发挥重要作用  14-19    2.1 Wnt/β-catenin与卵巢发育  14-17    2.2 β-catenin与激素调节  17-19  3 RNA干扰的作用机制及其应用  19-20    3.1 RNA干扰的作用机制  19    3.2 RNA干扰的研究方法  19-20    3.3 RNAi的转染  20    3.4 RNAi的应用  20  4 本研究的目的和意义  20-22  参考文献  22-26实验研究  26-58  试验一 β-catenin在猪卵巢组织中的表达  26-38    1 材料与方法  26-31      1.1 材料  26-27      1.2 方法  27-31    2 结果与分析  31-33      2.1 β-catenin在不同猪种卵巢中的表达  31      2.2 β-catenin在猪卵巢卵泡不同发育阶段的表达  31-32      2.3 β-catenin在猪卵巢颗粒细胞与卵母细胞中的表达  32-33    3 讨论  33-34    4 小结  34-36    参考文献  36-38  试验二 β-catenin对猪卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇生成酶的影响  38-58    1 材料与方法  38-46      1.1 材料  38-40      1.2 方法  40-45      1.3 数据统计分析  45-46    2 结果与分析  46-53      2.1 siRNA转染GCs的鉴定及效率分析  46      2.2 流式细胞仪检测FAM-siRNA转染颗粒细胞的效率  46-47      2.3 siRNA转染颗粒细胞对β-catenin表达的影响  47-48      2.4 LiCl激活Wnt/β-catenin后对卵巢颗粒细胞内β-catenin表达的影响  48-49      2.5 β-catenin对颗粒细胞凋亡的影响  49-50      2.6 β-catenin对猪卵巢颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响  50-51      2.7 β-catenin对猪卵巢颗粒细胞内激素作用相关酶的基因的表达的影响  51-53    3 讨论  53-55    4 小结  55-56    参考文献  56-58全文结论  58-60附录  60-62致谢  62

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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