学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

地克珠利对柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子甘油醛-3-磷酸脱氢酶的影响

作　者: 王丛丛
导　师: 薛飞群；江善祥
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 地克珠利 第二代裂殖子 GAPDH 克隆表达 细胞凋亡 酶活性
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 1次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


鸡球虫病是由一种或多种艾美耳属的单细胞球虫寄生于鸡的肠道不同部位所引起的一种肠道细胞内寄生性原虫病,给养殖业造成巨大的经济损失。至今为止,已知最为常见的艾美耳球虫有7种,其中柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的致病力最强。目前控制球虫病的主要方法还是药物防治,但是药物长期使用后不可避免的就会产生耐药性,所以迫切需要寻找药物靶标研发新的抗球虫药。现阶段使用最多疗效最好的抗球虫药为地克珠利,而到目前为止对其作用机制尚不明确。本实验室前期工作基因芯片和SSH技术的结果显示,地克珠利对E.tenella第二代裂殖子3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)有影响,所以本研究通过人工接种鸡E. tenella孢子化卵囊,分别建立感染组(接种卵囊+正常饲料)和地克珠利组(接种卵囊+1mg/kg地克珠利饲料)球虫感染模型,地克珠利添加时间为接种后第96 h到120 h,采用荧光定量PCR、Western-blot等技术研究地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH (mz-GAPDH) mRNA和蛋白表达量的影响。具体研究内容如下：1 E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因的克隆及分析在本实验室前期工作提供的mz-GAPDH部分编码框的基础之上,利用反转录PCR、PCR酶切鉴定和基因测序等技术对mz-GAPDH的部分编码框进行了克隆扩增,得到其编码框全长。并利用生物信息学软件对其结构进行了分析预测。结果表明：mz-GAPDH基因编码框为1020 bp,编码的GAPDH蛋白由339个氨基酸组成,分子量为36.38 KDa。结构功能域包括结合辅酶NAD+的N端和与底物结合发生催化功能的C端。BLAST结果表明,mz-GAPDH与刚地弓形虫GAPDH高度同源。2 GAPDH基因的表达、表达条件的优化及酶活性分析将获得的mz-GAPDH的完全编码框连接到表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pET-28a-mz-GAPDH,并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,通过降低温度、诱导剂的浓度和摇床的转数使融合蛋白在上清中大量表达,表达产物以His-Bind(?)Kit试剂盒进行纯化,紫外分光光度法对重组蛋白的酶活性进行分析,ELISA检测多克隆抗体的效价。结果显示：在IPTG为1 mmol/L、温度37℃条件下,mz-GAPDH以融合蛋白的形式在大肠杆菌菌中高效表达,表达产物以包涵体形式存在。通过对温度、IPTG浓度、摇床转速等条件的改变,最终确定其融合蛋白在上清中大量表达的最优条件为20℃、IPTG为0.1 mmol/L、摇床转数为120 rpm/min和LB培养基pH为7.0。重组蛋白具有酶活性,多克隆抗体的效价可以达到1：20000。3地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因mRNA转录及蛋白表达的影响采用荧光定量PCR和反转录PCR分析地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因mRNA表达的影响,应用Western-blot检测地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因蛋白表达量的影响。结果显示：地克珠利对mz-GAPDH基因mRNA转录水平上没有显著影响,而在蛋白水平上地克珠利作用后蛋白表达量上升了110%(P<0.01)。4地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH的免疫定位及酶活性的影响采用透射电子显微镜观察地克珠利E.tenella第二代裂殖子超微结构的影响,采用免疫荧光检测分析了地克珠利对mz-GAPDH在细胞内分布的影响,应用紫外分光光度法检测了地克珠利对mz-GAPDH酶活性的影响。结果表明：地克珠利组E.tenella第二代裂殖子细胞核染色质明显减少、发生异染色质化,凝集成大的团块、与核膜分离并发生趋边化,染色质固缩边集在核膜四周呈新月状小体,出现细胞凋亡的典型特征。同时发现地克珠利作用后GAPDH在细胞核出现了大量聚集。而且地克珠利作用后酶活性显著提高(P<O.01),提示GAPDH参与了地克珠利介导的裂殖子的细胞凋亡,这有可能是地克珠利抗球虫的作用机理之一。

全文目录


中文摘要  8-10ABSTRACT  10-12缩略符号  12-14引言  14-15第一章 文献综述  15-41  1 鸡球虫的简介  15-16    1.1 鸡球虫的分类  15    1.2 鸡球虫的生活史  15-16  2 鸡球虫病的防治  16-23    2.1 鸡球虫病的药物防治  17-20    2.2 鸡球虫病的疫苗防治  20-22    2.3 鸡球虫病的中草药防治  22-23  3 抗球虫药的作用机制  23-26    3.1 化学合成类抗球虫药  23-25    3.2 离子载体抗生素类  25-26  4 糖酵解途径  26-28  5 细胞凋亡的研究进展  28-31    5.1 细胞凋亡的生物学特征  28-29    5.2 细胞凋亡的机制  29    5.3 细胞凋亡相关的基因  29-31  6 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)  31-32  7 结束语  32-33  参考文献  33-41第二章 E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因的克隆及分析  41-63  1 材料与方法  41-49    1.1 实验动物  41-42    1.2 实验虫株  42    1.3 实验材料  42-43    1.4 实验方法  43-49  2 结果  49-59    2.1 E.tenella第二代裂殖子总RNA的提取  49    2.2 mz-GAPDH基因的PCR扩增  49-50    2.3 mz-GAPDH基因的克隆和鉴定  50-51    2.4 mz-GAPDH基因的测序  51-52    2.5 E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因的生物信息学分析  52-59  3 讨论  59-61  参考文献  61-63第三章 GAPDH基因的表达、表达条件的优化及酶活性分析  63-87  1 材料与方法  64-71    1.1 实验动物  64    1.2 实验虫株  64    1.3 实验材料  64-65    1.4 实验方法  65-71  2 结果  71-81    2.1 mz-GAPDH基因ORF的PCR产物  71-72    2.2 pET-28a-mz-GAPDH原核表达质粒的构建和鉴定  72-73    2.3 重组质粒pET-28a-mz-GAPDH测序  73    2.4 重组质粒pET-28a-mz-GAPDH的原核表达及蛋白表达形式分析  73-74    2.5 不同条件下融合蛋白的存在形式及最优表达条件  74-78    2.6 优化后融合蛋白的SDS-PAGE分析及纯化  78-79    2.7 重组蛋白mz-GAPDH酶活力的分析  79-80    2.8 多克隆抗体的效价分析  80    2.9 表达产物抗原性的鉴定  80-81  3 讨论  81-83  参考文献  83-87第四章 地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因mRNA及蛋白表达的影响  87-101  1 材料与方法  88-93    1.1 实验动物  88    1.2 实验虫株  88    1.3 实验材料  88-89    1.4 实验方法  89-93  2 结果  93-97    2.1 E.tenella第二代裂殖子总RNA质检结果  93    2.2 地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH基因mRNA表达的影响  93-96    2.3 地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH蛋白表达量的影响  96-97  3 讨论  97-98  参考文献  98-101第五章 地克珠利对E.tenella第二代裂殖子GAPDH的免疫定位及酶活性的影响  101-113  1 材料与方法  102-105    1.1 实验动物  102    1.2 实验虫株  102    1.3 实验材料  102-103    1.4 实验方法  103-105  2 结果  105-108    2.1 地克珠利对E.tenella第二代裂殖子超微结构的影响  105-106    2.2 免疫荧光检测地克珠利作用后mz-GAPDH在细胞内的分布  106-107    2.3 紫外分光光度计法测地克珠利对mz-GAPDH酶活性的影响  107-108  3 讨论  108-110  参考文献  110-113全文结论  113-115致谢  115-117攻读硕士学位期间发表的论文  117

相似论文

  1. 西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究,S968.3
  2. CADPE抗肿瘤作用及对胃癌细胞凋亡的影响,R735.2
  3. Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
  4. 环境因子对牡丹试管苗生根的影响,S685.11
  5. Thermobifida Halotolerans YIM 90462~T木聚糖酶基因克隆表达以及酶学特性研究,Q78
  6. 河南和云南烤烟碳氮代谢比较研究,S572
  7. 南京地区有机、特别及常规栽培对蔬菜产量、品质及土壤肥力的影响,S63
  8. 烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析,Q943.2
  9. 醋酸铅对鲤鱼卵巢上皮细胞毒性的研究,X174
  10. 禽致病性大肠杆菌鸭源分离株侵袭相关基因致病机理研究,S852.61
  11. 改良剂对铜镉复合污染土壤的原位修复研究,X53
  12. 烤烟根际土壤养分、酶活性和微生物动态变化研究,S572
  13. 铁、锰等微量元素对栽培丹参的生长和有效成分的影响,S567.53
  14. 种养结合梨园果实品质和土壤理化性质研究,S661.2
  15. PCV2对体外培养仔猪淋巴细胞钙信号的影响及其机理初探,S858.28
  16. β-catenin在猪卵巢组织中的表达以及对猪卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇生成酶的影响,S828
  17. 丙酮酸、肌酸及丙酮酸肌酸对肉鸡氨基酸谱的影响及相关酶活性的研究,S831.5
  18. 伏马菌素B1和黄曲霉毒素B1联合诱导Vero细胞凋亡的研究,S856.9
  19. 黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导锦鲤原代肝细胞凋亡机制的初步研究,S856.9
  20. 捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶基因克隆、表达、酶活性分析及重组谷氨酸脱氢酶活性测定,S852.7

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
© 2012 www.xueweilunwen.com