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伏马菌素B₁和黄曲霉毒素B₁联合诱导Vero细胞凋亡的研究

作　者: 冯璐璐
导　师: 张海彬
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 伏马菌素B1 黄曲霉毒素B1 细胞凋亡联合毒性
分类号: S856.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

伏马菌素是由串珠镰刀菌产生的一种水溶性的霉菌毒素,其中FB1是伏马菌素的主要组成部分,同时也是导致伏马菌素毒性的主要原因。FB1广泛存在于玉米及其制品中,对人类的健康以及畜牧业的发展构成了潜在的威胁。在体内、体外的研究中,FB1的毒性作用已经得以证实,包括肝、肾毒性,肺水肿,神经毒性,免疫抑制,以及致癌性等。研究表明FB1也具有较强的细胞毒性,但是目前关于FB1对细胞毒性研究的报道比较少,诱导细胞凋亡具体的信号转导机制的报道也不多。同时AFB1是由黄曲霉菌与寄生曲霉菌产生的一类次级代谢产物,也是目前已知的毒性最强的毒素,广泛存在于各种谷物和饲料中,而且还有致突变作用和致DNA损伤的作用,AFB1还能够引起诱发性肝癌,使肝脏广泛出血、坏死,对肾脏也有明显的损坏作用。鉴于两种毒素都广泛存在于各种谷物及其制品中,并且都能够产生肾毒性,所以本试验以FB1敏感细胞Vero细胞作为研究对象,经FB1和AFB1的单独和联合作用后,观察对Vero细胞的形态学、细胞的活性、线粒体膜电位以及凋亡时相关蛋白表达的变化的影响,探讨两种毒素诱导细胞凋亡的作用机制以及两者的联合作用,为深入研究FB1的毒性机理以及FB1诱导细胞凋亡的机制奠定了基础。试验一：本试验将处于对数期生长的Vero细胞以不同浓度的FB1和AFB1,以及两者的联合浓度进行处理,并设置空白培养基作为对照组。24 h后,采用MTT法测定各浓度组毒素对Vero细胞的毒性作用；于倒置显微镜下观察Vero细胞在形态学上的变化；用琼脂糖凝胶电泳来检测其DNA的完整性。结果显示：MTT法测定毒素对Vero细胞的增殖抑制率中,在作用时间相同的情况下,FB1和AFB1两种毒素单独作用时,随着毒素浓度的加大,细胞的增值抑制率也逐渐增大；当FB1分别与AFB1的两个浓度联合时,FB1的细胞增殖抑制率比单独时的抑制率都高,其ICs0也显著的降低。形态学上的变化显示,FB1从2500 ng.mL-1开始对Vero细胞产生较明显的凋亡作用,AFB115、30 ng.mL-1两个浓度对Vero细胞都具有诱导凋亡的作用,其中各浓度毒素组细胞的凋亡率都是显著高于对照组的(P<0.05)；琼脂糖凝胶电泳后,各试验组的细胞均形成DNAladder,证明细胞的DNA发生了断裂,引起了细胞的凋亡。试验二：本试验将处于对数期生长的Vero细胞以不同浓度的FB1和AFB1,以及两者的联合浓度进行处理,并设置空白培养基作为对照组。24h后,经JC-1染色后,用流式细胞仪来检测线粒体膜电位的变化情况。结果显示：线粒体膜电位的检测中,在作用时间相同的情况下,FB1单独时,从浓度2500 ng.mL-1开始与对照组相比差异显著,并且随着FB1浓度的逐渐增大,线粒体膜电位的下降程度也越来越明显,15 ng·mL-1 AFB1低浓度联合组以及30 ng·mL-’AFB1高浓度联合组中线粒体膜电位的下降程度都比FB1单独时下降的大。试验三：本部分试验采用免疫蛋白印迹(Western Blotting)检测FB1和AFB1单独和联合作用时凋亡相关蛋白caspase-3表达量的变化。结果显示：caspase-3蛋白的分子量为35 KD,经SDS-PAGE电泳、转印后,毒素处理组和正常对照组均在相应的位置出现了阳性的棕色条带,FB1单独组中,定量结果显示,随着毒素浓度的增加,caspase-3蛋白也相应的增加；当FB1分别与15.30 ng·mL-1 AFB1联合作用于Vero细胞时,产生的caspase-3蛋白与单独作用时相比,蛋白量有明显的增加。

全文目录

摘要 6-8ABSTRACT 8-10符号及缩略语 10-11第一篇文献综述 11-35 第一章伏马菌素B_1和黄曲霉毒素B_1的研究进展 11-21 1 伏马菌素B_1的研究进展 11-15 1.1 FB_1的产生及理化性质 11-12 1.2 FB_1的毒性作用 12-13 1.3 FB_1的污染情况及其限量标准 13-14 1.4 FB_1的联合毒性 14-15 2 黄曲霉毒素B_1的研究进展 15-18 2.1 AFB_1的产生及理化性质 15-16 2.2 AFB_1的毒性作用 16-17 2.3 AFB_1的污染情况及其限量标准 17 2.4 AFB_1的联合毒性 17-18 参考文献 18-21 第二章细胞凋亡的研究进展 21-35 1 细胞凋亡的概述 21-22 1.1 细胞凋亡的概念 21-22 1.2 细胞凋亡的生物学特性 22 2 细胞凋亡的通路 22-24 2.1 线粒体通路 23 2.2 内质网通路 23-24 2.3 死亡受体通路 24 3 细胞凋亡的检测 24-30 3.1 形态学的观察 25 3.2 DNA降解的分析 25-26 3.3 细胞凋亡的流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析 26-27 3.4 凋亡细胞线粒体跨膜电位和膜渗透性变化的检测 27-28 3.5 细胞凋亡的相关基因或蛋白的分析 28 3.6 细胞凋亡的酶学分析 28-29 3.7 细胞内钙浓度的检测 29-30 4 FB_1与细胞凋亡 30-32 参考文献 32-35第二篇试验研究 35-65 第三章 FB_1和AFB_1诱导Vero细胞凋亡在细胞增殖抑制率、形态学变化和DNA损伤上的研究 35-47 1 材料方法 35-38 1.1 材料 35-36 1.2 方法 36-38 2 结果 38-44 2.1 MTT法测定毒素对Vero细胞的毒性 38-39 2.2 FB_1和AFB_1对Vero细胞生长状态的影响 39-43 2.3 Vero细胞的DNA ladder 43-44 3 小结与讨论 44-46 参考文献 46-47 第四章 FB_1和AFB_1诱导Vero细胞凋亡在线粒体膜电位上的变化 47-57 1 材料和方法 47-48 1.1 材料 47 1.2 方法 47-48 2 结果 48-53 2.1 不同浓度FB_1作用于Vero细胞凋亡时线粒体膜电位的变化 48-50 2.2 不同浓度AFB_1作用于Vero细胞凋亡时线粒体膜电位的变化 50-51 2.3 两种毒素联合作用于Vero细胞凋亡时线粒体膜电位的变化 51-53 3 小结与讨论 53-54 参考文献 54-57 第五章 FB_1和AFB_1诱导Vero细胞凋亡途径中caspase-3的表达 57-65 1 材料方法 57-59 1.1 材料 57-58 1.2 方法 58-59 2 结果 59-62 2.1 不同浓度的FB_1作用于Vero细胞caspase-3蛋白的表达 59-60 2.2 不同浓度的AFB_1作用于Vero细胞caspase-3蛋白的表达 60-61 2.3 两种毒素联合作用于Vero细胞caspase-3蛋白的表达 61-62 3 小结与讨论 62-64 参考文献 64-65全文总结 65-67附录 67-71致谢 71

伏马菌素B1和黄曲霉毒素B1联合诱导Vero细胞凋亡的研究

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