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邻苯二甲酸丁苄酯对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞类雌激素样作用的影响

作　者: 张娟
导　师: 李涛
学　校: 华中科技大学
专　业: 卫生毒理学
关键词: 邻苯二甲酸丁苄酯 SH-SY5Y 细胞 芳香化酶 雌激素受体 cAMP 反应元件结合蛋白 雌激素
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


邻苯二甲酸丁苄酯(Butyl benzyl phthalate, BBP)是目前应用广泛的邻苯二甲酸酯类(phthalate esters, PAEs)之一,具有内分泌干扰作用。BBP作为增塑剂、软化剂、载体及添加剂,广泛用于塑料、汽车、润滑剂、化妆品、服装、农药等行业。在生产过程中,由于BBP并未与这些PVC共价牢固结合,随着塑料的大量使用、废弃,而使该化合物逐渐释放入环境中,对人群健康产生危害。人类BBP暴露的最重要途径就是食品,主要来源是PVC食品包装材料。近年来,BBP的毒性逐渐受到关注。据估计,成年人的BBP暴露量为平均8μg/kg/d,最高可达20μg/kg/d,而婴儿和儿童的暴露大约是成人的3倍。另有研究发现,Puerto Rico大学的Ivelisse Colon应用气质联用(GC/MS)技术测定了波多黎各岛41名性早熟女童与35名发育正常女童的血液样品,发现性早熟女童血液中BBP、DMP、DEP、DBP、DEHP的浓度明显高于对照组,在排除其他因素的干扰前提下,推测PAEs可能与当地女童早熟有关。众多学者研究认为,BBP作为一类雌激素类物质,进入人体后,可与相应的激素受体结合,干扰体内正常水平激素的维持,从而影响人的生长、发育和行为。如人体长期、慢性接触BBP,可导致内分泌紊乱、生殖机能失常等。BBP还可通过胎盘和授乳产生跨代影响。本室以往研究发现,母鼠妊娠期和哺乳期接触BBP,F1代大鼠脑组织CREST、BDNF、spinophilin mRNA表达均降低,且对雄性仔鼠学习记忆能力造成损害。综上所述,BBP的毒性作用不容忽视。以往对于BBP的污染以及危害的研究仍具有一定的局限性,因此有必要对其毒作用机制进行深入探讨。本研究以人神经母细胞瘤(SH-SY5Y细胞)为模型,研究BBP对SH-SY5Y细胞类雌激素样作用的影响,将为进一步了解BBP的神经毒作用机制提供科学依据。第一部分BBP对SH-SY5Y细胞毒性作用一、BBP对SH-SY5Y细胞活性的影响目的:探讨BBP对SH-SY5Y细胞活性的影响。方法:CCK-8法测定细胞活性。结果:(1)确定染毒时间为24 h,E2染毒剂量为0.1μmol/L,雌激素受体拮抗剂(ICI182,780)剂量为1μmol/L;(2)0.01、0.1μmol/L的BBP和0.1μmol/L E2对SH-SY5Y细胞存活率分别为113.10 %、114.76 %和115.45 %,与对照组相比细胞存活率明显升高,差异有统计学意义;30、300μmol /L BBP组SH-SY5Y细胞存活率明显降低,差异具有统计学意义;(3)BBP、E2可促进SH-SY5Y细胞增殖作用,而ICI182,780可逆转BBP、E2的细胞增值作用。结论:低剂量与高剂量BBP对SH-SY5Y细胞产生不同的效应,BBP的毒性作用可能是雌激素受体(ER)介导的。二、BBP对SH-SY5Y细胞凋亡的影响目的:研究BBP对SH-SY5Y细胞凋亡的影响,并初步探讨BBP诱导SH-SY5Y细胞凋亡的作用机制。方法:流式细胞仪PI-Annexin V双染法测定细胞凋亡。结果:(1)100、300 ?mol/L BBP组SH-SY5Y细胞凋亡率明显升高,与对照组比,差异均具有统计学意义(P <0.05);(2)0.01、0.1 ?mol/L BBP和0.1 ?mol/L E2可显著降低SH-SY5Y细胞的早期凋亡率和总凋亡率,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P <0.05);(3)ICI182,780预处理可逆转0.1μmol/L BBP和E2促进SH-SY5Y细胞凋亡率的升高作用。结论:低剂量BBP促进SH-SY5Y细胞增殖,细胞凋亡率降低;高剂量BBP抑制SH-SY5Y细胞生长,促进细胞凋亡, ICI182,780可以诱导BBP和E2引起的细胞凋亡。第二部分BBP对SH-SY5Y细胞分泌雌激素的影响目的:探讨BBP对SH-SY5Y细胞分泌雌激素水平的影响。方法:ELISA法检测BBP对SH-SY5Y细胞培养上清中雌激素水平的影响。结果:(1)0.01、0.1、10μmol/LBBP组SH-SY5Y细胞分泌雌激素水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P <0.05);(2)其他剂量BBP组SH-SY5Y细胞雌激素水平未见变化;(3)ICI182,780预处理可逆转0.1μmol/LBBP的雌激素水平升高作用。结论:低剂量组BBP可诱导SH-SY5Y细胞雌激素的分泌,并可能与ER有关。第三部分BBP对SH-SY5Y细胞芳香化酶的影响目的:探讨BBP对SH-SY5Y细胞芳香化酶的影响及其可能机制。方法:ELISA法检测BBP对SH-SY5Y细胞芳香化酶活性的影响;免疫荧光化学法、流式细胞术间接标记法、Western blotting法和荧光定量PCR法检测芳香化酶的表达。结果:(1)0.01、0.1μmol/L BBP组SH-SY5Y细胞芳香化酶活性明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);ICI182,780预处理可抑制0.1μmol/L BBP诱导SH-SY5Y细胞芳香化酶活性的升高作用;(2)免疫荧光化学法得到芳香化酶主要表达在SH-SY5Y的细胞浆中;流式细胞术结果发现,0.1、1μmol/L BBP组SH-SY5Y细胞芳香化酶的表达升高;western blotting检测发现,0.01、0.1、30μmol/L的BBP组SH-SY5Y细胞芳香化酶蛋白显著升高;0.01、0.1、30μmol/L BBP组SH-SY5Y细胞芳香化酶mRNA表达增加;(3)ICI182,780预处理可逆转0.1μmol/L BBP对SH-SY5Y细胞芳香化酶表达的影响。结论:低剂量的BBP上调SH-SY5Y细胞芳香化酶的活性和表达,ICI182,780预处理可逆转芳香化酶活性和表达的变化,提示BBP对SH-SY5Y细胞的毒性作用可能是ER介导的。第四部分BBP对SH-SY5Y细胞雌激素受体表达的影响目的:探讨BBP对SH-SY5Y细胞ER表达的影响。方法:Real time-PCR法测定SH-SY5Y细胞中ERα及ERβmRNA的表达水平。结果:(1)0.01μmol/L BBP组SH-SY5Y细胞ERβmRNA表达降低,与E2作用效应一致;(2)0.1、1、10μmol/L组SH-SY5Y细胞ERβmRNA表达未见变化;(3)30、100、300μmol/L BBP组ERβ基因表达显著增加,差异有统计学意义;(4)未检测出ERα的基因表达。结论:不同剂量BBP对SH-SY5Y细胞ERβmRNA表达的影响不同,提示作用机制可能存在差异。第五部分BBP对SH-SY5Y细胞CREB蛋白表达的影响目的:探讨BBP对SH-SY5Y细胞CREB表达的影响。方法:Western blotting法测定SH-SY5Y细胞中CREB蛋白表达的水平。结果:(1)0.01、0.1、30、100μmol/L的BBP上调SH-SY5Y细胞CREB蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05);(2)ICI182,780可逆转0.1μmol/L BBP促进CREB表达的升高作用。结论:BBP对SH-SY5Y细胞CREB蛋白表达的影响与对芳香化酶的影响一致,二者可能存在一定的联系,有待进一步探讨。

全文目录


中英文缩略词表  5-6
摘要  6-10
Abstract  10-15
前言  15-19
  一、目的与意义  15-16
  二、研究内容和技术路线  16-18
  参考文献  18-19
第一部分 BBP 对SH-SY5Y 细胞毒性作用研究  19-29
  一、BBP 对SH-SY5Y 细胞活性的影响  19-22
  二、BBP 对SH-SY5Y 细胞凋亡的影响  22-27
  参考文献  27-29
第二部分 BBP 对SH-SY5Y 细胞分泌雌激素的影响  29-35
  材料与方法  29-31
  结果  31-33
  讨论  33-34
  参考文献  34-35
第三部分 BBP 对SH-SY5Y 细胞芳香化酶的影响  35-63
  一、BBP 对SH-SY5Y 细胞芳香化酶活性的影响  35-40
  二、免疫荧光化学法检测 BBP 对 SH-SY5Y 细胞芳香化酶蛋白表达的影响  40-42
  三、FCM 法检测BBP 对SH-SY5Y 细胞芳香化酶蛋白表达的影响  42-45
  四、Western blotting 法检测BBP 对SH-SY5Y 细胞芳香化酶蛋白表达的影响  45-53
  五、BBP 对SH-SY5Y 细胞芳香化酶mRNA 表达水平的影响  53-61
  参考文献  61-63
第四部分 BBP 对SH-SY5Y 细胞雌激素受体表达的影响  63-68
  材料与方法  63-64
  结果  64-65
  讨论  65-66
  参考文献  66-68
第五部分 BBP 对SH-SY5Y 细胞CREB 蛋白表达的影响  68-73
  材料与方法  68-69
  结果  69-70
  讨论  70-71
  参考文献  71-73
总结  73-74
综述  74-94
  参考文献  88-94
附录：附图  94-100
致谢  100

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 神经系肿瘤
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