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脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导仓鼠肾细胞凋亡信号转导机制的研究

作 者: 丁举静
导 师: 张海彬
学 校: 南京农业大学
专 业: 临床兽医学
关键词: 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 BHK-21细胞 细胞凋亡 信号转导机制
分类号: S856.9
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


目的:脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又名呕吐毒素(vomitoxin),是由镰刀菌属病原真菌产生的真菌毒素之一。DON广泛污染谷类及其制品,严重威胁人和动物的健康。研究报道DON具有很强的细胞毒性,对于原核细胞、真核细胞等均具有明显的毒性作用,DON可抑制DNA、RNA和蛋白质的合成,抑制线粒体功能并诱导细胞凋亡。其中诱导细胞凋亡是DON发挥致病作用,产生免疫毒性的重要途径之一,也是近年来霉菌毒素研究领域中的热点问题。目前关于DON对细胞毒性研究的报道较多,但关于DON诱导细胞凋亡具体的信号转导机制还很少有报道。鉴于上述情况,本实验选用DON敏感细胞株仓鼠肾细胞BHK-21为研究对象,经DON处理后,观察其对BHK-21细胞的形态学、线粒体膜电位及凋亡通路相关蛋白表达变化的影响,以其探讨DON诱导细胞凋亡的作用机制,为深入研究DON的毒性机理、全面了解DON的生物学作用奠定基础。试验一:本试验将处于对数生长期的BHK-21细胞以不同浓度的DON (DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000ng mL-1)进行处理,另设空白培养基对照组。24h后,倒置显微镜观察细胞的形态学改变,琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。结果显示:不同浓度的DON对BHK-21均有诱导凋亡的作用,各浓度组的凋亡率都显著高于对照组(P<0.05);细胞DNA发生断裂,形成DNA ladder。试验二:本试验将处于对数生长期的BHK-21细胞以不同浓度的DON (DON终浓度分别为125、250、500、1000、2000 ng mL-1)进行处理不同时间(6h、12h、24h)后,JC-1染色,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化情况。结果显示:在DON作用时间(24h)相同的情况下,除125 ng mL-1外,其他各浓度组与对照组相比均差异显著(P<0.05),随着DON浓度的增大,线粒体膜电位下降的程度越明显;在DON浓度(2000 ng mL-1)相同的情况下,各试验组与对照组相比均差异显著(P<0.05),随着DON作用时间的延长,细胞线粒体膜电位呈逐渐下降的趋势。采用细胞免疫化学染色检测不同浓度的DON处理对BHK-21细胞中Bax、Bcl-2、p53表达的变化,结果显示,DON处理细胞24 h,Bax、p53蛋白表达显著高于对照组,Bcl-2蛋白表达均低于对照组。试验三:采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)检测不同浓度的DON处理对BHK-21细胞中caspase-3、caspase-9、AIF、caspase-12蛋白表达的变化。蛋白免疫印迹结果显示:caspase-3、caspase-9、AIF、caspase-12蛋白分子量分别为35 KD、47 KD、57 KD、55 KD经SDS-PAGE电泳、转膜后,细胞对照组、DON处理组均在相应位置出现了棕色的阳性条带,且随DON浓度的增加阳性条带颜色逐渐加深,宽度逐渐增加。以actin(42KD)作为内参照,采用图像分析系统对杂交条带进行定量分析,进一步证实给予DON处理可以促进BHK-21细胞中caspase-3、caspase-9、AIF、caspase-12蛋白的表达。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11符号及缩略语  11-12第一篇 文献综述  12-34  第一章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒性研究进展  12-22    1 DON的产生及理化特性  12-13    2 DON的污染情况  13-14    3 DON的毒性作用  14-18      3.1 DON对动物的毒性  14-15      3.2 DON对人的毒性  15      3.3 DON的致呕吐作用  15      3.4 DON的免疫毒性  15-16      3.5 DON的生殖遗传毒性  16      3.6 DON的三致(致畸、致癌、致突变)毒性  16      3.7 DON的细胞毒性  16-17      3.8 DON的联合毒性  17-18    参考文献  18-22  第二章 细胞凋亡的研究进展  22-34    1 细胞凋亡的概念  22-23    2 细胞凋亡的生物学特性  23-24    3 CASPASE与细胞凋亡  24    4 细胞凋亡的主要调控基因  24-26    5 细胞凋亡途径与信号转导  26-27      5.1 细胞膜上死亡受体途径  26      5.2 线粒体凋亡途径的信号转导  26-27      5.3 内质网凋亡途径  27    6 细胞凋亡的检测  27-28      6.1 形态学观察  27      6.2 生化检测常见的方法  27-28    7 DON与细胞凋亡  28-30    参考文献  30-34第二篇 试验研究  34-68  第三章 DON诱导BHK-21细胞凋亡的形态学变化和DNA损伤的研究  34-40    1 材料和方法  34-36      1.1 材料  34-35      1.2 方法  35-36    2 结果  36-37      2.1 DON对BHK-21细胞生长状态的影响  36-37      2.2 BHK-21的DNA ladder  37    3 讨论  37-39    参考文献  39-40  第四章 DON诱导BHK-21细胞凋亡的线粒体膜电位及凋亡调控基因的表达  40-56    1 材料和方法  40-43      1.1 材料  40-41      1.2 方法  41-43    2 结果  43-50      2.1 DON对BHK-21细胞线粒体膜电位的影响  43-46      2.2 免疫细胞化学染色检测凋亡调控基因Bax、Bcl-2、p53表达的变化  46-50    3 讨论  50-53    参考文献  53-56  第五章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导BHK-21细胞凋亡途径的研究  56-68    1 材料和方法  57-60      1.1 材料  57      1.2 方法  57-60    2 结果  60-62      2.1 蛋白免疫印迹检测Caspase-3蛋白表达  60      2.2 蛋白免疫印迹检测Caspase-9蛋白表达  60-61      2.3 蛋白免疫印迹检测凋亡诱导因子AIF的表达  61-62      2.4 蛋白免疫印迹检测caspase-12的蛋白表达  62    3 讨论  62-66    参考文献  66-68全文总结  68-70附录  70-74致谢  74-76攻读硕士学位期间发表的论文  76

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医内科学 > 其他
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