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大肠杆菌产CotA蛋白的高效诱导表达、分离纯化及酶学性质的研究

作　者: 张宁
导　师: 赵敏
学　校: 东北林业大学
专　业: 微生物
关键词: CotA蛋白 发酵条件 纯化 酶学性质
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


CotA漆酶在环境保护、食品工业和纸浆漂白等工业中具有重要的应用价值。由东北林业大学微生物实验室构建并保存的含表达载体的pET-22b(+)/cotA转入到Escherichia coli BL21(DE3)中,得到工程菌株。采用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究异源诱导表达和发酵条件对重组大肠杆菌产CotA漆酶量的影响。通过渗透压破胞法释放粗CotA蛋白,并对其进行纯化、酶学性质及染料脱色等方面研究。(1)初始pH7.5的培养基中,500mL锥形瓶中装入150mL培养基,添加0.6mmol/L Cu2+,1g/L葡萄糖作碳源、15g/L蛋白胨和2g/L硫酸铵作氮源,以3%的接种量,37℃180r/min,直到菌液的OD6oo nm值为1.0,加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG,25℃诱导12h,漆酶的产量最高。优化前发酵液的粗提液的漆酶活性仅为1190U/mL,优化后达到3526U/mL,正交实验优化后漆酶活性提高了2.96倍。(2)本文使用纯化方法(硫酸铵盐析、半透膜透析、PEG20000浓缩、DEAE-Sepharose FF离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤),从含CotA漆酶粗提液中纯化出CotA漆酶,纯化的重组漆酶在SDS-PAGE上显示单一条带,大小约为67.5kDa,与天然CotA分子量大小(65kDa)相似。最终回收率为27.83%,纯化倍数为5.26。纯化的CotA漆酶经过Native-PAGE后,可以使丁香醛连氮(3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛)显红色。(3)对菌株E. coli BL21(DE3)所产CotA漆酶的酶学性质进行研究。纯化CotA漆酶与原始芽孢漆酶有一系列相似的特性。其最适反应温度为45℃,和最适反应pH为7.2。pH7.2条件下,80℃时CotA漆酶活性半衰期tl/2为0.5h。在最适反应温度45℃下,pH9.0时CotA漆酶活性半衰期t1/2达到8h。Cu2+和Ca2+对CotA漆酶活性的提高有较强促进作用；EDTA和Zn2+对CotA漆酶的活性有很强抑制作用；而K+、Na+和Fe2+对CotA漆酶的影响不大；以丁香醛联氮为底物,测得该酶Km值为1.10mmol/mL。(4)CotA漆酶能够在12h内有效降解不同的偶氮和葸醌染料,如RBBR.刚果红、甲基橙和结晶紫的降解率分别为93.15%、90.03%、59.92%和55.14%。这样的降解能力使得该工程菌株应用于废水中染料降解成为现实。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
1 绪论  10-20
  1.1 CotA蛋白  10-13
    1.1.1 CotA蛋白的来源和位置  10
    1.1.2 CotA蛋白的特性  10
    1.1.3 CotA蛋白的同源性  10-12
    1.1.4 CotA蛋白的结构  12-13
  1.2 漆酶的种类  13-14
  1.3 有关细菌漆酶的研究  14-16
    1.3.1 细菌漆酶的生物学研究  14-15
    1.3.2 细菌漆酶的培养条件的优化技术  15-16
    1.3.3 细菌漆酶酶活的测定  16
  1.4 CotA漆酶的应用前景  16-17
    1.4.1 环境保护  16-17
    1.4.2 造纸工业  17
    1.4.3 生物燃料电池  17
    1.4.4 其他领域  17
  1.5 本课题来源及研究目的和意义  17-18
    1.5.1 课题来源  17
    1.5.2 本研究的目的和意义  17-18
  1.6 展望  18-20
2 大肠杆菌BL2 1(DE3)产CotA漆酶的发酵条件优化  20-34
  2.1 材料  20-21
    2.1.1 供试菌株  20
    2.1.2 培养基  20
    2.1.3 药品及试剂配制  20
    2.1.4 仪器设备  20-21
  2.2 实验方法  21-25
    2.2.1 CotA漆酶的制备  21
    2.2.2 CotA漆酶酶活的测定  21-22
    2.2.3 SDS-PAGE  22-23
    2.2.4 诱导条件的测定  23
    2.2.5 工程菌株产CotA漆酶最适培养条件的优化  23-24
    2.2.6 工程菌株产CotA漆酶最适培养基的优化  24-25
  2.3 分析  25-32
    2.3.1 CotA漆酶最佳诱导条件的测定  25-27
    2.3.2 产酶最适培养环境的优化  27-29
    2.3.3 培养基对工程菌株产漆酶的影响  29-32
  2.4 讨论  32
  2.5 本章小结  32-34
3 大肠杆菌BL21(DE3 )产CotA漆酶纯化方法研究  34-44
  3.1 材料  34-35
    3.1.1 菌株  34
    3.1.2 培养基  34
    3.1.3 药品和试剂  34
    3.1.4 仪器与设备  34-35
  3.2 方法  35-39
    3.2.1 CotA的诱导表达  35
    3.2.2 CotA漆酶酶活的测定及蛋白含量的测定  35-36
    3.2.3 硫酸铵盐析  36
    3.2.4 透析  36
    3.2.5 聚乙二醇(PEG20000)浓缩  36
    3.2.6 DEAE-Sepharose FF(1.6×50 cm)离子交换层析  36-38
    3.2.7 SephadexG-75凝胶过滤(1.6×50cm)  38
    3.2.8 SDS-PAGE凝胶电泳  38-39
  3.3 结果分析  39-42
    3.3.1 硫酸铵最佳饱和度选择  39
    3.3.2 离子交换层析上样缓冲体系pH值及洗脱离子强度的确定  39-40
    3.3.3 DEAE-Sepharose离子交换层析  40-41
    3.3.4 Sephadex G-75凝胶过滤  41-42
  3.4 讨论  42-43
  3.5 本章小结  43-44
4 纯化CotA漆酶的酶学性质研究  44-53
  4.1 材料  44
    4.1.1 菌种  44
    4.1.2 试剂和药品  44
    4.1.3 仪器与设备  44
  4.2 方法  44-46
    4.2.1 纯化的CotA漆酶的制备  44
    4.2.2 CotA漆酶酶活的测定  44
    4.2.3 CotA漆酶酶学性质研究  44-45
    4.2.4 CotA漆酶染料降解研究  45-46
  4.3 结果与分析  46-51
    4.3.1 CotA漆酶酶学性质  46-49
    4.3.2 染料脱色  49-51
  4.4 讨论  51
  4.5 本章小结  51-53
结论  53-54
参考文献  54-58
附录A 主要试剂  58-59
附录B 主要试剂配制方法  59-61
攻读学位期间发表的学术论文  61-62
致谢  62-63

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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