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具细菌漆酶活性的芽孢外壁蛋白CotA基因克隆及异源表达研究

作　者: 汪春蕾
导　师: 赵敏
学　校: 东北林业大学
专　业: 森林生物工程
关键词: 枯草芽孢杆菌 CotA蛋白 细菌漆酶 造纸黑液 异源表达
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本文从五常林区和凉水国家级自然保护区的森林土壤中筛选出一株具有高漆酶活性的细菌菌株,通过形态学特征、生理生化特性及16S rDNA分析,鉴定该细菌属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,定名为Bacillus subtilis WD23。该菌株的产芽孢率与其细菌漆酶酶活成正相关,说明该芽孢杆菌的外壁蛋白具有漆酶活性,可能来源于芽孢外壁组成蛋白CotA。使用B. subtilis WD23芽孢对偶氮和蒽醌类染料进行脱色试验,在24h内脱色率能达到50-90%,用其固定化的芽孢处理造纸黑液,处理7d色度下降24.9%,COD下降31.2%。利用GenBank上公布的B. subtilis CotA基因序列设计上、下游引物,克隆B. subtilis WD23的CotA基因,并转化Escherich coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导其CotA蛋白表达,分子量约为65 kDa,测定工程菌株发酵液的粗提液的漆酶活性达到1700U/mL,表明该菌株漆酶活性来源于其芽孢外衣蛋白CotA。采用特异的His标签纯化试剂盒对CotA蛋白进行纯化。CotA漆酶对RBBR和刚果红的脱色率在87%以上,对靛红和结晶紫的脱色率也达55%以上。本文的主要研究内容和结果如下：(1)利用铜离子作为筛选剂,从凉水国家级自然保护区的土壤中筛选出一株具有高漆酶活性的菌株。其菌落在含0.2 mmol/LCu2+的培养基上呈灰白色而在不含Cu2+的培养基上呈浅红色。该菌株革兰氏染色反应呈阳性,菌体为短杆状,1-2μm长,能形成芽孢,具有鞭毛和运动性,不能利用木糖和阿拉伯糖这两种典型的枯草芽孢杆菌能利用的碳源。该菌株的16S rDNA片段长度为1513bp,在GenBank中的登录序号为EU780682。由构建的系统发育树分析,该菌株与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的同源性为100%。综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA分析,鉴定该细菌属于Bacillus subtilis,将此菌株定名为Bacillus subtilis WD23.(2)通过对B. subtilis WD23的生物学特性研究,得出其最适生长温度是30℃,最适生长pH为7.0,具有一定的抗盐、抗铜、抗紫外线和抗H2O2的能力。(3)以丁香醛连氮作为底物,测定菌株WD23细菌芽孢漆酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.8。B. subtilis WD23芽孢漆酶具有很好的热稳定性及pH稳定性,在80℃高温下,其活性半衰期为2.5h,在pH9.0,60℃的条件下,其活性半衰期达10d。EDTA、甲醇和Zn2+等化学物质都强烈抑制细菌芽孢漆酶的活性,而Cu2+、Fe2+和Mg2+却可以增强细菌芽孢漆酶的活性。B. subtilis WD23的芽孢漆酶在24h之内使RBBR和茜素红脱色率达90%以上,刚果红、甲基橙和结晶紫的脱色率也达50%以上,显示了本研究所采用的细菌芽孢漆酶在染料降解上具有很大的应用潜力。(4)固定化芽孢漆酶最适反应温度为70℃。最适反应pH为6.8。固定化芽孢漆酶贮存于30℃,pH 6.8的封闭容器内,其活性半衰期t1/2超过7个月。固定酶的米氏常数Km较非固定化酶的米氏常数Km小。(5)采用固定式填充床装置,利用固定化微胶囊处理造纸黑液,固定化菌株WD23的芽孢漆酶处理黑液的COD去除率为31.19%,固定化真菌新月弯胞霉处理黑液的COD去除率45.86%,二者联合处理黑液的COD去除率却能达到为61.31%,说明共代谢作用更有利于处理像造纸黑液这样的难处理的复杂污染废水。(6)以B. subtilis WD23总DNA为模板,扩增得到1558 bp CotA基因,通过BLAST比对,其与枯草芽孢杆菌的CotA基因同源性很高,达到99%,可见克隆的序列为CotA基因。(7)构建重组表达载体pET22b/CotA,测序得到CotA基因序列共有1542 bp,在GenBank数据库中的登陆号为GQ184294,其氨基酸序列在GenBank数据库中的登陆号为ACS44284。用阳性重组子的质粒转化表达菌株E. coli BL21(DE3),得到了CotA基因的异源表达菌株。用IPTG诱导CotA基因表达,经SDS-PAGE检测到表达的CotA蛋白在粗提液中,用丁香醛连氮作底物,测定粗提液的漆酶活性达到1700 U/mL,表明菌株WD23的漆酶活性来源其芽孢CotA蛋白。为了提高漆酶的产量,优化了漆酶诱导表达条件,结果表明：诱导剂IPTG的浓度为1.0 mmol/L,加入IPTG时菌液的OD600值为1.0,诱导温度为25℃和诱导时间为15h漆酶的产量最高。(8)利用BioEdit软件对CotA氨基酸的亲疏水性进行分析,其亲水性比较强的,表明其易于表达。利用BLAST软件对B. subtilis WD23的CotA蛋白的保守结构分析,其含有铜氧化酶超家族。用Clust X软件将B. subtilis WD23的CotA氨基酸序列与一些典型的细菌和真菌漆酶进行比对,结果表明其与真菌的漆酶氨基酸序列之间的相似度非常低,而与细菌漆酶如E.coli cueO、嗜热栖热菌、薰衣草链霉菌和抗生素链霉菌的漆酶之间的相似度也比较低,但与1GSK_A (B.subtilis CotA)的同源性很高。(9)采用特异的His标签纯化试剂盒对CotA蛋白进行纯化的效果比较好,经Native-PAGE,纯化的CotA蛋白在pH5.0条件下被0.1%丁香醛连氮染成红色。以丁香醛连氮为底物测定CotA漆酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为7.2。pH7.2条件下,80℃时CotA漆酶活性半衰期t1/2为0.5h。在最适反应温度45℃下,pH9.0时CotA漆酶活性半衰期t1/2达到8h。CotA蛋白的Km值小于芽孢漆酶的Km值。CotA漆酶对RBBR和刚果红的脱色率在87%以上,对靛红和结晶紫的脱色率也达55%以上,此CotA漆酶在短时间内对染料能够有效地脱色,能够成为有潜力的工业用酶。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-17
1 绪论  17-34
  1.1 课题背景  17-18
    1.1.1 课题来源  17
    1.1.2 课题的目的和意义  17
    1.1.3 课题的研究内容及创新点  17-18
  1.2 漆酶的研究概况  18-21
    1.2.1 漆酶的来源、种类及分布  18
    1.2.2 漆酶的结构、特性及其作用机理  18-19
    1.2.3 漆酶的应用  19-21
  1.3 细菌漆酶研究概况  21-28
    1.3.1 产漆酶细菌的种类  21-23
    1.3.2 产漆酶细菌筛选方法进展  23-24
    1.3.3 细菌漆酶酶学性质的研究方法进展  24-26
    1.3.4 细菌漆酶应用的研究进展  26-28
  1.4 细菌漆酶的分子生物学研究进展  28
  1.5 固定化酶技术  28-30
    1.5.1 固定化酶的定义  28-29
    1.5.2 固定化酶的优点  29
    1.5.3 酶的固定化方法  29-30
    1.5.4 固定化酶的应用  30
  1.6 大肠杆菌表达系统  30-34
    1.6.1 大肠杆菌表达系统特点  30-31
    1.6.2 表达系统的构成  31-32
    1.6.3 重组基因的表达特点  32-34
2 产漆酶细菌的筛选与鉴定  34-48
  2.1 实验材料与仪器  34-36
    2.1.1 材料  34
    2.1.2 试剂  34
    2.1.3 仪器  34-35
    2.1.4 试剂配制及培养基  35-36
  2.2 实验方法  36-42
    2.2.1 筛选方法  36-37
    2.2.2 形态特性研究  37-38
    2.2.3 生理生化特性研究  38-39
    2.2.4 16S rDNA鉴定  39-42
  2.3 结果与分析  42-45
    2.3.1 高产漆酶菌株的分离  42
    2.3.2 形态及生理生化特性  42-43
    2.3.3 分子生物学鉴定  43-45
  2.4 讨论  45-47
  2.5 本章小结  47-48
3 B.subtilis WD23的生物学及其酶学性质研究  48-62
  3.1 实验材料与仪器  48-49
    3.1.1 材料  48
    3.1.2 试剂与培养基  48
    3.1.3 仪器  48-49
  3.2 实验方法  49-52
    3.2.1 Bacillus subtilis WD23的生物学特性  49
    3.2.2 粗提液的制备与酶活测定  49-50
    3.2.3 细菌芽孢漆酶酶学性质研究  50-51
    3.2.4 细菌芽孢漆酶对染料的脱色实验  51-52
  3.3 结果与分析  52-60
    3.3.1 Bacillus subtilis WD23的生物学特性  52-55
    3.3.2 产芽孢率与细菌漆酶活性的关系  55-56
    3.3.3 细菌芽孢漆酶酶学性质研究  56-59
    3.3.4 细菌芽孢漆酶对染料的脱色实验  59-60
  3.4 讨论  60
  3.5 本章小结  60-62
4 细菌芽孢漆酶的固定化及其应用  62-73
  4.1 实验材料  62-63
    4.1.1 菌株  62
    4.1.2 试剂与培养基  62
    4.1.3 仪器  62-63
  4.2 实验方法  63-67
    4.2.1 固定化细菌芽孢漆酶微胶囊的制备  63
    4.2.2 微胶囊性能测定方法  63
    4.2.3 芽孢漆酶酶活测定方法  63-64
    4.2.4 固定化芽孢漆酶酶学性质  64-65
    4.2.5 造纸废水黑液的降解试验  65-67
  4.3 结果与分析  67-71
    4.3.1 微胶囊性能测定  67
    4.3.2 固定化芽孢漆酶酶学性质  67-70
    4.3.3 造纸废水黑液的降解试验  70-71
  4.4 讨论  71-72
  4.5 本章小结  72-73
5 B.subtilis WD23的CotA基因的克隆与异源表达  73-108
  5.1 材料  73-74
    5.1.1 菌株  73
    5.1.2 试剂  73
    5.1.3 仪器  73-74
    5.1.4 试剂配制及培养基  74
  5.2 实验方法  74-84
    5.2.1 Bacillus subtilis CotA基因的克隆  74-77
    5.2.2 pET22b/CotA重组表达载体的构建及鉴定  77-82
    5.2.3 CotA重组蛋白的诱导表达条件的优化  82-84
  5.3 结果与分析  84-104
    5.3.1 CotA基因的PCR扩增  84-85
    5.3.2 重组质粒pMD18-T/CotA的构建及鉴定  85-86
    5.3.3 pET22b/CotA重组表达载体的构建及鉴定  86-101
    5.3.4 CotA重组蛋白的诱导表达条件的优化  101-104
  5.4 讨论  104-106
  5.5 本章小结  106-108
6 CotA蛋白的纯化及其酶学特性的研究  108-121
  6.1 实验材料  108-110
    6.1.1 菌种  108
    6.1.2 试剂  108
    6.1.3 仪器  108
    6.1.4 试剂配制  108-110
  6.2 实验方法  110-114
    6.2.1 CotA蛋白的纯化  110-112
    6.2.2 CotA漆酶酶学性质的研究  112-113
    6.2.3 CotA漆酶对染料的脱色实验  113-114
  6.3 结果与分析  114-119
    6.3.1 CotA蛋白的纯化  114-115
    6.3.2 CotA漆酶酶学性质的研究  115-119
    6.3.3 CotA漆酶对染料的脱色实验  119
  6.4 讨论  119
  6.5 本章小结  119-121
结论  121-123
参考文献  123-131
攻读学位期间发表的学术论文  131-132
致谢  132-133

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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