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人源β-防御素-6的原核表达及纯化

作　者: 马鹏
导　师: 赖仞
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物学
关键词: 人源β-防御素-6 原核表达分离纯化抑菌活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是生物体内天然免疫系统中的重要组成部分,通常由12-45个氨基酸组成,因为其富含精氨酸和赖氨酸残基,所以主要以阳离子形式存在。目前大量不同类型的抗菌肽已从各种生物包括细菌、真菌、植物、昆虫、两栖类动物、鱼类、鸟类、哺乳类动物和人体中分离出来,并得到鉴定。多数抗菌肽都具有广谱抗菌作用,它们对革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌都有杀灭作用,而且有效作用浓度极低,有些甚至在pM浓度下就可完全抑制细菌的生长。与传统抗生素相比,抗菌肽最大的优点在于它们作用迅速,且不易产生耐药性。防御素是抗菌肽家族中最大的亚家族,是一类重要的内源性抗菌肽,具有稳定的分子结构和众多生物活性,是生物体天然免疫的重要组成部分。依据空间结构的不同,防御素可分为3大类：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。其中在动物科学领域中,β-防御素有较好的研究价值,不易产生抗药性和毒性,因而受到广泛关注,成为近年来国内外研究热点。人源p-防御素-6在国内外还没有研究报道,本论文通过基因工程手段构建了重组人源p-防御素-6(hDefb6)表达质粒pET-32a(+)-hDefb6,利用pET原核表达系统使hDefb6在大肠杆菌中得到成功表达。通过镍离子亲和层析、甲酸化学切割、SephadexG-50凝胶层析和RP-HPLC等分离纯化手段得到了纯度较高的hDefb6。抑菌活性检测结果显示：hDefb6抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli, ATCC 25922)和真菌白色念珠菌(Candida albicans, ATCC 2002)生长的最小浓度分别为37μg·mL-1和50μg·mL-1。当hDefb6的浓度为200μg·mL-1时尚未检测出其对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, ATCC 2592)的生长有抑制作用。

全文目录

摘要 6-7ABSTRACT 7-8缩略词对照一览表 8-9第一章文献综述 9-20 1 抗菌肽 9-15 1.1 抗菌肽的分类 9-10 1.2 抗菌肽的生物学活性 10-12 1.3 抗菌肽的作用机制 12-15 2 防御素 15-20 2.1 防御素的分类 16 2.2 防御素的生物学功能 16-18 2.3 应用前景 18-20第二章人源β-防御素-6的原核表达 20-37 第一节化学合成法获取人源β-防御素-6成熟肽编码基因片段 20-23 1 材料与方法 20-21 1.1 材料 20 1.2 方法 20-21 2 结果与分析 21 3 小结 21-23 第二节原核表达重组载体pET-32a(+)-hDefb6的构建 23-31 1 材料与方法 23-27 1.1 材料 23 1.2 方法 23-27 2 结果与分析 27-29 2.1 pUC57质粒和pET-32a(+)质粒的提取 27 2.2 目的基因载体和表达质粒的双酶切鉴定 27-28 2.3 重组质粒的菌落PCR鉴定 28-29 2.4 重组质粒的测序鉴定 29 3 小结 29-31 第三节目的基因在大肠杆菌中的诱导表达 31-37 1 材料与方法 31-32 1.1 材料 31 1.2 方法 31-32 2 结果与分析 32-36 2.1 重组蛋白的小量诱导表达 32-33 2.2 重组蛋白的可溶性检测 33-34 2.3 重组蛋白质诱导表达条件的优化 34-36 3 小结 36-37第三章人源β-防御素-6重组蛋白的纯化 37-46 1 材料和方法 37-40 1.1 材料 37 1.2 方法 37-40 2 结果与分析 40-45 2.1 目的蛋白hDe-6的释放 40-41 2.2 Sephadex G-50凝胶层析 41 2.3 抑菌活性检测 41-43 2.4 RP-HPLC分离纯化及活性检测 43-45 2.5 最小抑菌浓度(MIC)测定 45 3 小结 45-46全文总结 46-47参考文献 47-51创新之处 51-52致谢 52-53附录 53-57

人源β-防御素-6的原核表达及纯化

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