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扩展青霉TS414脂肪酶在毕赤酵母的表达、纯化及其催化外消旋萘普生酯化拆分的研究

作　者: 蔡志雄
导　师: 唐良华
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 脂肪酶 发酵 分离纯化 萘普生 固定化 酯化 拆分
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本论文以扩展青霉TS414脂肪酶在毕赤酵母X-33的表达、纯化和重组扩展青霉TS414脂肪酶在有机相中催化外消旋萘普生酯化拆分为主线,开展了以下几个方面的研究：首先,优化了X33-TS414-lip工程菌的摇瓶发酵条件：pH为7.5、接种量为20D、甲醇浓度为0.75%、摇瓶装量为10%、转速为250rpm、温度为30℃。进一步在摇瓶优化的基础上考察三种不同的甲醇流加策略对该菌进行罐上产脂肪酶的影响。溶氧控制策略的酶活为104U/ml,酶产率为962U/1·h；变色酸法维持低浓度甲醇策略的酶活为443U/ml,酶产率为4614.58 U/1·h；甘油甲醇混合诱导过渡策略的酶活为573U/ml,产率为6821.43U/1·h,经优化后发酵策略的酶产率为溶氧控制策略的5.51倍。其次,重组扩展TS414脂肪酶发酵液经过饱和硫酸铵沉淀、Sephacryl S-100凝胶过滤层析、Phenyl Sepharose疏水层析三个纯化步骤后达到电泳纯,酶液的比酶活力由最初2988.03 U/mg提高至7909.74U/mg,提高了2.65倍,活性回收率为39.69%。重组TS414脂肪酶对外消旋萘普生的拆分效果与野生型脂肪酶相近。最后,确立固定化重组扩展青霉TS414脂肪酶酯化拆分萘普生的最佳反应条件：一、固定化条件：天津光复AB-8大孔吸附树脂、树脂与酶质量比为1：8、pH值为9.0、固定化吸附时间1.5h、冻干1 h；二、酯化拆分体系：固定化酶量为0.06g、外消旋萘普生量为1.48mg、正丙醇量为7.73μl、体系水含量为0.05%。在此条件下反应120h,转化率及产物对映体选择性分别达到48.27%和98.01%。固定化重组扩展青霉TS414脂肪酶酯化拆分萘普生的效果较理想。

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中文摘要  2-3Abstract  3-5中文文摘  5-7目录  7-13第1章 绪论  13-37  1.1 毕赤酵母高效表达脂肪酶的研究进展  13-17    1.1.1 毕赤酵母表达系统的概述  13    1.1.2 脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达  13-14    1.1.3 毕赤酵母的发酵策略  14-16    1.1.4 毕赤酵母表达蛋白的纯化策略  16-17      1.1.4.1 重组蛋白纯化的一般策略  16-17      1.1.4.2 毕赤酵母表达重组脂肪酶的纯化策略  17  1.2 脂肪酶在非水相催化的研究进展  17-24    1.2.1 脂肪酶的概述  17-18    1.2.2 脂肪酶的酶学特性  18-21      1.2.2.1 脂肪酶的分子结构  18-19      1.2.2.2 脂肪酶的催化机制  19-20      1.2.2.3 脂肪酶的底物特异性  20-21    1.2.3 脂肪酶在非水相界面的催化的应用  21-22    1.2.4 脂肪酶的固定化  22-24      1.2.4.1 固定化酶的概述  22-24      1.2.4.2 脂肪酶的固定化研究  24  1.3. 非甾体手性药物的酶法拆分  24-34    1.3.1 手性药物拆分的重要性  24-25    1.3.2 手性拆分技术的应用  25-28      1.3.2.1 手性色谱法  26-27      1.3.2.2 物理结晶法  27      1.3.2.3 化学拆分法  27-28      1.3.2.4 酶法动力学拆分在手性拆分中的应用  28    1.3.3 2-芳香丙酸类非甾体药物的酶法拆分  28-30    1.3.4 萘普生的酶法拆分  30-32      1.3.4.1 萘普生的不对称水解拆分  30-31      1.3.4.2 萘普生的酯化拆分  31-32    1.3.5 2-芳香丙酸类手性药物酶法拆分的影响因素  32-34      1.3.5.1 有机溶剂  32-33      1.3.5.2 水含量  33      1.3.5.3 pH值  33-34      1.3.5.4 添加剂  34      1.3.5.5 温度  34  1.4 本论文的研究思路及其主要内容  34-37第2章 毕赤酵母表达扩展青霉TS414脂肪酶的发酵条件优化  37-57  2.1 前言  37-38  2.2 材料和方法  38-39    2.2.1 菌种  38    2.2.2 试剂  38    2.2.3 仪器  38-39    2.2.4 培养基  39      2.2.4.1 培养基储液的配置  39      2.2.4.2 酵母培养基  39  2.3 实验方法  39-44    2.3.1 分光光度计法测定脂肪酶活力  39-40    2.3.2 脂肪酶酶活单位定义  40    2.3.3 酵母工程菌X33-TS414-lip发酵工艺优化  40-42      2.3.3.1 摇瓶发酵培养基条件的优化  40-41        2.3.3.1.1 不同起始pH培养基的影响  40-41        2.3.3.1.2 不同接种量的影响  41        2.3.3.1.3 不同甲醇浓度的影响  41      2.3.3.2 摇瓶培养条件的优化  41-42        2.3.3.2.1 不同摇瓶装量的影响  41        2.3.3.2.2 不同摇床速度的影响  41-42        2.3.3.2.3 不同温度的影响  42        2.3.3.2.4 不同诱导时间的影响  42    2.3.4 酵母工程菌X33-TS414-lip的罐上发酵  42-44      2.3.4.1 HPLC法测定发酵液中甘油浓度  42      2.3.4.2 变色酸法测定发酵液中甲醇浓度  42-43      2.3.4.3 发酵罐种子培养液的制备  43-44        2.3.4.3.1 一级菌种的制备  43        2.3.4.3.2 二级菌种的制备  43        2.3.4.3.3 上罐发酵  43        2.3.4.3.4 菌体湿重的测定  43-44  2.4 结果与讨论  44-54    2.4.1 酵母工程菌X33-TS414-lip发酵工艺优化  44-48      2.4.1.1 不同起始pH培养基对脂肪酶表达的影响  44-45      2.4.1.2 不同接种量对脂肪酶表达的影响  45      2.4.1.3 不同甲醇浓度对脂肪酶表达的影响  45-46      2.4.1.4 不同摇瓶装量对脂肪酶表达的影响  46      2.4.1.5 不同摇瓶转速对脂肪酶表达的影响  46-47      2.4.1.6 不同发酵温度对脂肪酶表达的影响  47-48      2.4.1.7 诱导时间对脂肪酶表达的影响  48    2.4.2 X33-TS414-lip产脂肪酶的罐上优化  48-54      2.4.2.1 HPLC法检测发酵液中甘油浓度的标准曲线  48-49      2.4.2.2 变色酸法检测发酵罐中发酵的甲醇浓度标准曲线  49-50      2.4.2.3 三种不同的甲醇流加策略对罐上产脂肪酶的影响  50-54        2.4.2.3.1 溶氧参数控制甲醇流加策略  50-51        2.4.2.3.2 变色酸法维持低甲醇浓度策略  51-53        2.4.2.3.3 甘油甲醇混合诱导过渡策略  53-54  2.5 小结  54-57第3章 重组扩展青霉TS414脂肪酶的分离纯化  57-69  3.1 前言  57  3.2 材料与方法  57-61    3.2.1 材料  57    3.2.2 试剂  57-58    3.2.3 仪器  58    3.2.4 蛋白含量检测  58-59    3.2.5 脂肪酶酶活检测及酶活单位定义  59    3.2.6 SDS-PAGE电泳储液配制及分析方法  59    3.2.7 硫酸铵沉淀  59-60    3.2.8 Sephacryl S-100凝胶层析  60    3.2.9 疏水层析  60    3.2.10 超滤浓缩  60    3.2.11 野生型TS414脂肪酶与重组TS414脂肪酶对萘普生拆分的比较  60-61  3.3 结果与讨论  61-67    3.3.1 蛋白含量标准曲线  61    3.3.2 硫酸铵沉淀  61-63    3.3.3 Sephacryl S-100凝胶层析  63-64    3.3.4 Phenyl Sepharose疏水层析  64    3.3.5 重组脂肪酶的分离纯化结果  64-66    3.3.6 超滤浓缩  66-67    3.3.7 野生型TS414脂肪酶与重组型TS414脂肪酶酯化拆分萘普生的比较  67  3.4 小结  67-69第4章 重组扩展青霉TS414脂肪酶催化萘普生酯化拆分的研究  69-91  4.1 前言  69-70  4.2 材料和方法  70-72    4.2.1 脂肪酶  70    4.2.2 试剂  70    4.2.3 实验仪器  70-71    4.2.4 实验方法  71-72      4.2.4.1 对照品的溶液的制备  71        4.2.4.1.1 萘普生样品的制备  71        4.2.4.1.2 萘普生丙酯的化学合成方法  71      4.2.4.2 转化率和对映体选择率的计算方法  71-72      4.2.4.3 酶粉的制备  72      4.2.4.4 大孔吸附树脂的预处理  72      4.2.4.5 脂肪酶的吸附固定化  72      4.2.4.6 固定化脂肪酶酯化拆分萘普生的酶促反应  72  4.3 结果与讨论  72-88    4.3.1 萘普生酯化拆分HPLC分析检测方法的建立  72-74    4.3.2 扩展青霉TS414脂肪酶固定化方法的优化  74-79      4.3.2.1 固定化载体的筛选  74-76      4.3.2.2 树脂与酶粉比例的影响  76-77      4.3.2.3 吸附时间的影响  77      4.3.2.4 pH值对固定化脂肪酶活性的影响  77-78      4.3.2.5 冻干时间的影响  78-79    4.3.3 固定化脂肪酶酯化拆分萘普生反应条件的优化  79-88      4.3.3.1 摇床转速对固定化酶酯化拆分的影响  79-80      4.3.3.2 温度对萘普生酯分拆分的影响  80-81      4.3.3.3 有机溶剂对萘普生酯化拆分的影响  81      4.3.3.4 底物醇对萘普生酯化拆分的影响  81-82      4.3.3.5 均匀设计优化萘普生拆分反应体系  82-85      4.3.3.6 外加水含量对萘普生酯化拆分的影响  85-86      4.3.3.7 脂肪酶催化消旋萘普生拆分的时间曲线  86      4.3.3.8 固定化酶的操作稳定性  86-87      4.3.3.9 几种脂肪酶酯化拆分外消旋萘普生的比较  87-88  4.4 小结  88-91第5章 总结与展望  91-95  5.1 创新点  91  5.2 总结  91-93  5.3 展望  93-95附录1  95-97附录2  97-99参考文献  99-109攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  109-111致谢  111-113个人简历  113-114

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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