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免疫磁珠纯化人呼吸道合胞病毒融合蛋白方法的建立

作　者: 方璇
导　师: 何金生
学　校: 安徽医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 免疫磁珠人呼吸道合胞病毒 F蛋白纯化夹心ELISA
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)是造成世界范围内婴幼儿下呼吸道病毒性感染最重要的病原。RSV融合(fusion glycoprotein, F)蛋白编码基因变异小,在RSV的两个亚型间具有高度的保守性,是主要的交叉保护性抗原和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)的靶抗原。以纯化的F蛋白制成的亚单位疫苗(PFP-1、PFP-2和PFP-3)对成人和儿童具有一定的保护作用,显示其在疫苗研制中具有较好价值,同时,纯化的RSV F蛋白对开发RSV血清学诊断试剂也具有重要意义。本文尝试用免疫磁珠分离技术从可表达RSV F蛋白的重组腺病毒感染的HEK293细胞裂解液中纯化F蛋白,试图建立一种方便、简洁的纯化F蛋白的方法。方法:本文首先以RSV感染HEp-2细胞,待细胞出现病变(cytopathic effect, CPE)后,收获细胞及培养液,离心,取上清,PEG6000沉淀,沉淀物经溶解后通过蔗糖密度梯度离心纯化。以纯化的RSV作为抗原,免疫家兔制备RSV抗血清,经纯化后,获得RSV多克隆抗体,并用此抗体包被磁性微球,并确定包被磁珠所需的抗体浓度和包被时间。用可表达RSV F的重组腺病毒FGAd/F感染293细胞,收获细胞裂解液,利用包被好兔抗人RSV多克隆抗体的免疫磁珠富集和纯化细胞裂解液中的F蛋白,同时建立夹心ELISA,检测纯化的F蛋白浓度以及F蛋白的回收率。结果:获得兔抗人RSV多克隆抗体,并包被磁性微球形成免疫磁珠,并利用免疫磁珠分离技术成功纯化可表达RSV F的重组腺病毒FGAd/F感染293细胞裂解液中的F蛋白,经SDS-PAGE,Western blot鉴定为分子量为145 kD-170 kD区间的F蛋白二聚体,再由夹心ELISA建立标准曲线,检测免疫磁珠分离技术纯化的RSV F蛋白浓度为116μg/mL,成功的利用免疫磁珠分离技术从含有141μg的F蛋白的细胞裂解液中提取58μg的F蛋白,回收率为41.1%。结论:本研究成功的利用免疫磁珠分离技术从可表达RSV F的重组腺病毒FGAd/F感染293细胞裂解液中提取F蛋白,此方法方便快速,减少了常规纯化F蛋白繁琐,昂贵等缺点,也为制备F蛋白提供了一条新的思路。

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中英文缩略词表 5-7中文摘要 7-9Abstract 9-11实验设计与流程 11-121、前言 12-162、实验材料和方法 16-293.结果 29-404 讨论 40-445.结论 44-456.参考文献 45-48附录 48-49致谢 49-50免疫磁珠的研究进展 50-59 参考文献 56-59

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