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Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达

作　者: 司圣乾
导　师: 林琳
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 低温脂肪酶 Pseudomonas sp. 纯化 发酵条件优化 基因克隆 表达
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


Pseudomonas sp. RT-1是本课题组从采自福州某农场的样品中分离得到的碱性低温脂肪酶产生菌。研究表明该菌是革兰氏阴性菌,经16S rRNA鉴定和进化树分析,该菌株属于假单胞杆菌属,命名为Pseudomonas sp. RT-1。该菌经发酵可产生和分泌胞外脂肪酶,其最适作用温度为18℃,为低温脂肪酶,却具有很好的耐高温特性。本文在前期工作基础上进行了该菌产生的脂肪酶发酵条件的优化、蛋白质的纯化、酶学特性研究、基因克隆和在大肠杆菌中的活性表达等研究：用单因素-响应面相结合的方法优化了该菌的摇瓶发酵条件；对该菌产生的胞外脂肪酶进行了纯化,对其酶学特性进行了初步研究；用CODHOP法设计的引物,通过降落PCR的方法从其基因组中克隆了该脂肪酶基因并在大肠杆菌中实现了该基因的活性表达。发酵条件优化：通过单因素实验找出Pseudomonas sp. RT-1最适的C源、N源、装样量和发酵时间后,利用Plackett-Burman设计筛选出对发酵酶活力影响最大的三个因素为：温度、K2HPO4和起始pH。通过最陡爬坡实验找出产酶量最大的区域,在这个区域中进行Box-Behnken响应面设计,得出温度、K2HPO4和起始pH的最优值分别为：16.73℃、0.37%和pH 9.46。优化后发酵液酶活力由优化前的5.8 U/mL提高到了33.45 U/mL,提高了5.77倍。蛋白纯化和酶学特性：Pseudomonas sp. RT-1的发酵上清液经过60%(NH4)2SO4沉淀、透析、Sephadex G-75分子筛凝胶过滤可以得到电泳纯的脂肪酶,其表观分子量为44.3kDa。对其酶学特性研究表明：该脂肪酶是低温碱性脂肪酶,在10～40℃内有较好的催化活性,最适作用温度为18℃；在0～50℃的温度范围内该酶的稳定性较好,当温度超过50℃时则容易失活；该酶为碱性脂肪酶,最适作用pH为10.2,在pH9～11时较稳定；该酶对有机溶剂的耐受性较好,某些金属离子如10 mmol/L的Ca2+、K+、Na+Fe3+对该酶的活力有促进作用,其中Ca2+促进作用最为明显,可使酶活力提高146.07%。该脂肪酶对C链长度小于或等于12的短链脂肪酸形成的甘油三酯具有较强的水解能力。基因克隆表达：用CODHOP法设计的引物通过降落PCR的方法从Pseudomonassp.RT-1基因组中扩增一个开放阅读框(ORF)1413 bp、编码470个氨基酸的基因序列,该序列中包含脂肪酶的特征序列G-H-S-L-G和Ca2+结合序列GXXGXD。用SWISS-MODEL服务器对该脂肪酶进行同源建模获得该脂肪酶的模拟空间结构,整个分子为一个中心为若干个β-折叠、周围包裹着α-螺旋的结构,这种结构与Pseudomonas aeruginosa脂肪酶的X-衍射三维结构相似。将该基因引入大肠杆菌BL21(DE3)中,实现了其在大肠杆菌中的的外源表达,表达的脂肪酶以可溶性的形式存在并具有酶活力。

全文目录


中文摘要  2-4Abstract  4-6中文文摘  6-9目录  9-12绪论  12-28  1.1 脂肪酶简介  12-16    1.1.1 脂肪酶及来源  12-13    1.1.2 脂肪酶的结构和催化机制  13-15    1.1.3 脂肪酶的应用  15-16  1.2 低温脂肪酶  16-27    1.2.1 低温脂肪酶简介  16-17    1.2.2 低温脂肪酶的来源  17-18    1.2.3 低温脂肪酶的结构特征  18-20    1.2.4 低温脂肪酶的纯化和酶学特性  20-23    1.2.5 低温脂肪酶的克隆表达  23-25    1.2.6 低温脂肪酶的应用  25-27  1.3 本课题研究的背景和目的  27-28第一章 单因素-响应面法优化Pseudomonas sp.RT-1产脂肪酶条件  28-44  2.1 材料  28-29    2.1.1 菌种  28    2.1.2 试剂与药品  28    2.1.3 仪器  28-29    2.1.4 培养基  29  2.2 方法  29-34    2.2.1 脂肪酶酶活力的测定  29-31    2.2.2 单因素实验  31-32    2.2.3 Plackett—Burman设计  32-33    2.2.4 最陡爬坡实验  33    2.2.5 Box-Behnken响应面设计  33-34  2.3 结果和分析  34-42    2.3.1 单因素实验  34-36    2.3.2 Plackett—Burman设计  36-37    2.3.3 最陡爬坡实验  37-38    2.3.4 Box-Behnken响应面设计  38-42  2.4 讨论和小结  42-44第二章 Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶的纯化与酶学特性研究  44-54  3.1 材料  44-45    3.1.1 菌种  44    3.1.2 试剂与药品  44    3.1.3 仪器  44-45    3.1.4 主要培养基和溶液的配制  45  3.2 方法  45-46    3.2.1 脂肪酶酶活力的、蛋白质浓度和脂肪酶表观分子量的测定  45    3.2.2 Pseudomonas sp.RT-1脂肪酶的纯化  45-46    3.2.3 Pseudomonas sp.RT-1脂肪酶的理化性质分析  46  3.3 结果与分析  46-53    3.3.1 Pseudomonas sp.RT-1脂肪酶的纯化  46-48    3.3.2 Pseudomonas sp.RT-1脂肪酶理化性质分析  48-53  3.4 讨论和小结  53-54第三章 Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶基因的克隆表达  54-72  4.1 材料  54-55    4.1.1 菌种和质粒  54    4.1.2 试剂与药品  54    4.1.3 仪器  54    4.1.4 培养基和试剂配制  54-55    4.1.5 主要数据库和软件  55  4.2 方法  55-61    4.2.1 Pseudomonas sp.RT-1脂肪酶基因的克隆  55-60    4.2.2 Pseudomonas sp.RT-1脂肪酶基因的表达  60-61  4.3 结果和分析  61-70    4.3.1 Pseudomonas sp.RT-1脂肪酶基因的克隆  61-67    4.3.2 Pseudomonas sp.RT-1脂肪酶基因的表达  67-70  4.4 讨论  70-72第四章 结论  72-74附录 英文缩略词表  74-76参考文献  76-86攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  86-88致谢  88-90个人简历  90-91

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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