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新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究

作　者: 刘孝龙
导　师: 刘玉焕
学　校: 中山大学
专　业: 生物技术
关键词: 菊酯类农药降解酶原核表达酶学性质定向进化
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

拟除虫菊酯类农药具有杀虫活性高、杀虫方式多样和用量少等优点,广泛应用于人们的生产和生活中,占整个农药市场的20%以上。但研究发现,其对环境和非目标生物并非完全安全,菊酯类农药的残留问题越来越受到重视。目前,对拟除虫菊酯类农药残留的处理方法主要有物理法、化学法和生物法,其中生物法尤其是生物酶类,在处理拟除虫菊酯类农药的残留时,具有操作简单、安全高效、应用范围广且无二次污染等优点,因而,在污染环境的修复中具有广阔的应用前景。本研究采用大肠杆菌表达系统,诱导表达来源于海底泥宏基因组文库的新型菊酯类农药降解酯酶基因est825。通过表达条件优化和酶学性质研究,在30℃、1.0 mM IPTG条件下诱导8 h,该重组酯酶（Est825）得到高效可溶表达,表达量为200 mg/L;SDS-PAGE电泳分析Est825的分子量为34.1 kDa（其中还有4 kDa的融合标签）;最适反应温度和pH值分别为40℃和6.5;70℃保温2 h后,仍保留50%的酶活性,表明Est825具有较好的热稳定性;1 mM Al³⁺以及1% （w/v） Triton X-100和Tween 80对Est825具有不同程度的激活作用;37℃反应1 h,Est825对氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率分别达到80.66%、84.95%、81.90%和76.75%,表明其具有广泛的底物特异性和较好的菊酯类农药降解能力。为进一步提高Est825对菊酯类农药的降解能力,本研究利用易错PCR对est825进行体外定向进化,获得突变酶EstM46。研究突变酶的酶学性质,并与野生酶比较,其酶活性提高1.5倍;最适反应温度提高至45℃;70℃保温2 h后保留约80%的酶活性,热稳定性得到了进一步提高;在相同的条件下,EstM46对上述四种菊酯类农药的降解率分别提升至92.21%、99.75%、93.21%和89.48%,表明突变酶对菊酯类农药的降解能力更强,在处理菊酯类农药残留方面具有良好的应用潜力。

全文目录

摘要 3-5ABSTRACT 5-9第1章前言 9-34 1.1 农药发展概况 9-10 1.2 拟除虫菊酯类杀虫剂的发展概况 10-14 1.3 拟除虫菊酯类杀虫剂的残留问题 14-16 1.4 拟除虫菊酯残留的处理方法 16-17 1.5 菊酯类农药的微生物降解 17-21 1.6 宏基因组学 21-22 1.7 大肠杆菌(E.coli)表达系统 22-24 1.8 酶的分子改造 24-33 1.9 本文的研究目的和意义 33-34第2章酯酶基因est825 的原核表达条件研究 34-58 引言 34 2.1 材料 34-38 2.2 方法 38-47 2.3 结果 47-55 2.4 讨论 55-57 2.5 小结 57-58第3章重组酯酶Est825 的酶学性质和农药降解能力研究 58-80 引言 58 3.1 材料 58-62 3.2 方法 62-68 3.3 结果 68-76 3.4 讨论 76-79 3.5 小结 79-80第4章酯酶基因est825 的定向进化研究 80-97 引言 80-81 4.1 材料 81-82 4.2 方法 82-89 4.3 结果 89-95 4.4 讨论 95-96 4.5 小结 96-97第5章突变酯酶EstM46 的酶学性质及菊酯类农药降解能力研究 97-107 引言 97 5.1 材料 97-98 5.2 方法 98-99 5.3 结果 99-105 5.4 讨论 105-106 5.5 小结 106-107总结与展望 107-110参考文献 110-121缩略词 121-122致谢 122

新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究

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