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易错PCR定向进化扩展青霉FS1884脂肪酶
作 者: 陈明
导 师: 施碧红
学 校: 福建师范大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 定向进化 易错PCR 脂肪酶 酶学性质
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
扩展青霉Penicillium expansum)FS1884碱性脂肪酶(PEL)已被广泛应用,为进一步增强工业适用性,获得活性更高,耐酸碱等性质进化的脂肪酶,本文利用连续两轮易错PCR对扩展青霉FS1884碱性脂肪酶进行随机突变,在大肠杆菌内构建了约106个突变克隆子的脂肪酶基因突变文库,将携带突变脂肪酶基因的重组质粒pPIC3.5K-ep-PEL转化巴斯德毕赤酵母GS115,经过YPOM板和橄榄油检验板的筛选,获得突变体GS-ep25-PEL、GS-ep10-PEL、GS-ep33-PEL、GS-ep43-PEL、GS-ep51-PEL和GS-ep81-PEL,并对上述突变体进行酶学性质鉴定。结果显示,GS-ep25-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为1912.5U/mL,是毕赤酵母中野生型脂肪酶(GS-PEL)在该条件下酶活的130%,Tm值为40℃,pH 11.0时有最高酶活。GS-ep10-PEL的最适温度为35℃,酶活力为2478.7 U/mL,是GS-PEL酶活力的168.6%,Tm值为40.2℃,pH11.0时酶活最高。GS-ep33-PEL最适作用温度没有发生变化,40℃时酶活力为1561.67 U/mL,是GS-PEL的106.2%,Tm值是39.9℃,比GS-PEL降低0.4℃,最适pH不变。GS-ep43-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为895.44U/mL,是GS-PEL的60.9%,Tm值是36.6℃,比GS-PEL降低3.6℃oGS-ep51-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为1448.4U/mL,是GS-PEL的98.5%,Tm值为40.5℃,比GS-PEL提高0.2℃。GS-ep81-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为1540.3U/mL,是GS-PEL的104.7%,Tm值是38.8℃,比GS-PEL降低了1.5℃。测序结果显示,GS-ep25-PEL,GS-ep10-PEL,GS-ep33-PEL和GS-ep43-PEL脂肪酶突变体基因长度都未发生改变。与GS-PEL比较,突变脂肪酶GS-ep25-PEL产生一个氨基酸突变,即K253M。突变脂肪酶GS-ep10-PEL有四个氨基酸发生变化,分别为1104T,A188T,G192S,K253MoGS-ep33-PEL有三个氨基酸发生突变,它们是A18T,K147M,D150E。GS-ep43-PEL产生两个氨基酸突变,分别是K63R以及R128G。
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全文目录
中文摘要 2-3Abstract 3-4中文文摘 4-7目录 7-10第一章 绪论 10-26 1.1 酶的体外改造 10-18 1.1.1 理性进化 10-12 1.1.2 非理性进化 12-16 1.1.2.1 易错PCR 12-14 1.1.2.2 DNA重组 14-15 1.1.2.3 交错延伸法 15 1.1.2.4 随机引物体外重组法 15 1.1.2.5 临时模板随机嵌合生长 15-16 1.1.2.6 酵母胞内重组增强文库法 16 1.1.2.7 渐进平截产杂合酶法 16 1.1.3 高通量筛选 16-18 1.1.3.1 表型筛选 17 1.1.3.2 展示技术 17-18 1.2 毕赤酵母表达系统 18-24 1.2.1 启动子 19-20 1.2.2 载体 20-21 1.2.3 宿主菌株 21-22 1.2.4 提高外源蛋白表达策略 22-24 1.2.4.1 选择合适的信号肽 22-23 1.2.4.2 控制发酵过程参数 23-24 1.3 实验目的和意义 24-26第二章 易错PCR定向进化扩展青霉FS1884碱性脂肪酶 26-54 2.1 引言 26 2.2 材料与方法 26-36 2.2.1 实验材料 26-30 2.2.1.1 菌种和质粒 26 2.2.1.2 酶和实验药品 26-27 2.2.1.3 常用仪器 27 2.2.1.4 培养基 27-28 2.2.1.5 试剂和缓冲液 28-29 2.2.1.6 引物 29-30 2.2.2 实验方法 30-36 2.2.2.1 pPIC3.5 K质粒的大量制备 30 2.2.2.2 易错PCR获取突变脂肪酶基因 30-31 2.2.2.3 突变脂肪酶重组表达载体构建 31-32 2.2.2.4 获得脂肪酶基因随机突变库 32-33 2.2.2.5 突变脂肪酶在毕赤酵母的表达 33-34 2.2.2.6 突变脂肪酶的初筛 34 2.2.2.7 突变脂肪酶的复筛 34-35 2.2.2.8 突变脂肪酶理化性质鉴定 35-36 2.3 实验结果与分析 36-51 2.3.1 脂肪酶突变基因的制备 36-37 2.3.2 脂肪酶突变基因表达载体的选择 37 2.3.3 基因突变库的获得 37-38 2.3.4 突变脂肪酶表达载体电击转化巴斯德毕赤酵母GS115 38-40 2.3.4.1 线性化位点选择 38-39 2.3.4.2 电击转化毕赤酵母GS115 39-40 2.3.5 酵母转化子的初筛 40-41 2.3.6 酵母转化子的复筛 41-42 2.3.7 酶学性质初步分析 42-51 2.3.7.1 野生型脂肪酶GS-PEL的酶学性质 42-43 2.3.7.2 突变体GS-ep25-PEL的酶学性质 43-45 2.3.7.3 突变体GS-ep10-PEL的酶学性质 45-46 2.3.7.4 突变体GS-ep33-PEL的酶学性质 46-48 2.3.7.5 突变体GS-ep43-PEL的酶学性质 48-49 2.3.7.6 突变体GS-ep51-PEL的酶学性质 49-50 2.3.7.7 突变体GS-ep81-PEL的酶学性质 50-51 2.4 小结 51-54第三章 突变脂肪酶基因的克隆与测序 54-68 3.1 引言 54 3.2 材料与方法 54-57 3.2.1 实验材料 54-55 3.2.1.1 菌种和质粒 54 3.2.1.2 酶和实验药品 54 3.2.1.3 常用仪器 54-55 3.2.1.4 培养基及试剂 55 3.2.1.5 引物 55 3.2.2 实验方法 55-57 3.2.2.1 酵母基因组简易提取 55-56 3.2.2.2 突变脂肪酶基因的获得 56 3.2.2.3 构建表达载体及转化 56 3.2.2.4 阳性克隆子检测及目的片段测序 56-57 3.3 结果与分析 57-64 3.3.1 脂肪酶突变基因克隆 57-58 3.3.2 表达载体转化及重组子验证 58 3.3.3 突变脂肪酶序列分析 58-64 3.3.3.1 突变脂肪酶GS-ep25-PEL 58-60 3.3.3.2 突变脂肪酶GS-ep10-PEL 60-61 3.3.3.3 突变脂肪酶GS-ep33-PEL 61-62 3.3.3.4 突变脂肪酶GS-ep43-PEL 62-64 3.4 小结与讨论 64-68第四章 小结与展望 68-70参考文献 70-78攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 78-80致谢 80-82个人简历 82-83
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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