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易错PCR定向进化扩展青霉FS1884脂肪酶

作 者: 陈明
导 师: 施碧红
学 校: 福建师范大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 定向进化 易错PCR 脂肪酶 酶学性质
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


扩展青霉Penicillium expansum)FS1884碱性脂肪酶(PEL)已被广泛应用,为进一步增强工业适用性,获得活性更高,耐酸碱等性质进化的脂肪酶,本文利用连续两轮易错PCR对扩展青霉FS1884碱性脂肪酶进行随机突变,在大肠杆菌内构建了约106个突变克隆子的脂肪酶基因突变文库,将携带突变脂肪酶基因的重组质粒pPIC3.5K-ep-PEL转化巴斯德毕赤酵母GS115,经过YPOM板和橄榄油检验板的筛选,获得突变体GS-ep25-PEL、GS-ep10-PEL、GS-ep33-PEL、GS-ep43-PEL、GS-ep51-PEL和GS-ep81-PEL,并对上述突变体进行酶学性质鉴定。结果显示,GS-ep25-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为1912.5U/mL,是毕赤酵母中野生型脂肪酶(GS-PEL)在该条件下酶活的130%,Tm值为40℃,pH 11.0时有最高酶活。GS-ep10-PEL的最适温度为35℃,酶活力为2478.7 U/mL,是GS-PEL酶活力的168.6%,Tm值为40.2℃,pH11.0时酶活最高。GS-ep33-PEL最适作用温度没有发生变化,40℃时酶活力为1561.67 U/mL,是GS-PEL的106.2%,Tm值是39.9℃,比GS-PEL降低0.4℃,最适pH不变。GS-ep43-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为895.44U/mL,是GS-PEL的60.9%,Tm值是36.6℃,比GS-PEL降低3.6℃oGS-ep51-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为1448.4U/mL,是GS-PEL的98.5%,Tm值为40.5℃,比GS-PEL提高0.2℃。GS-ep81-PEL最适温度为40℃,该温度下酶活力为1540.3U/mL,是GS-PEL的104.7%,Tm值是38.8℃,比GS-PEL降低了1.5℃。测序结果显示,GS-ep25-PEL,GS-ep10-PEL,GS-ep33-PEL和GS-ep43-PEL脂肪酶突变体基因长度都未发生改变。与GS-PEL比较,突变脂肪酶GS-ep25-PEL产生一个氨基酸突变,即K253M。突变脂肪酶GS-ep10-PEL有四个氨基酸发生变化,分别为1104T,A188T,G192S,K253MoGS-ep33-PEL有三个氨基酸发生突变,它们是A18T,K147M,D150E。GS-ep43-PEL产生两个氨基酸突变,分别是K63R以及R128G。

全文目录


中文摘要  2-3Abstract  3-4中文文摘  4-7目录  7-10第一章 绪论  10-26  1.1 酶的体外改造  10-18    1.1.1 理性进化  10-12    1.1.2 非理性进化  12-16      1.1.2.1 易错PCR  12-14      1.1.2.2 DNA重组  14-15      1.1.2.3 交错延伸法  15      1.1.2.4 随机引物体外重组法  15      1.1.2.5 临时模板随机嵌合生长  15-16      1.1.2.6 酵母胞内重组增强文库法  16      1.1.2.7 渐进平截产杂合酶法  16    1.1.3 高通量筛选  16-18      1.1.3.1 表型筛选  17      1.1.3.2 展示技术  17-18  1.2 毕赤酵母表达系统  18-24    1.2.1 启动子  19-20    1.2.2 载体  20-21    1.2.3 宿主菌株  21-22    1.2.4 提高外源蛋白表达策略  22-24      1.2.4.1 选择合适的信号肽  22-23      1.2.4.2 控制发酵过程参数  23-24  1.3 实验目的和意义  24-26第二章 易错PCR定向进化扩展青霉FS1884碱性脂肪酶  26-54  2.1 引言  26  2.2 材料与方法  26-36    2.2.1 实验材料  26-30      2.2.1.1 菌种和质粒  26      2.2.1.2 酶和实验药品  26-27      2.2.1.3 常用仪器  27      2.2.1.4 培养基  27-28      2.2.1.5 试剂和缓冲液  28-29      2.2.1.6 引物  29-30    2.2.2 实验方法  30-36      2.2.2.1 pPIC3.5 K质粒的大量制备  30      2.2.2.2 易错PCR获取突变脂肪酶基因  30-31      2.2.2.3 突变脂肪酶重组表达载体构建  31-32      2.2.2.4 获得脂肪酶基因随机突变库  32-33      2.2.2.5 突变脂肪酶在毕赤酵母的表达  33-34      2.2.2.6 突变脂肪酶的初筛  34      2.2.2.7 突变脂肪酶的复筛  34-35      2.2.2.8 突变脂肪酶理化性质鉴定  35-36  2.3 实验结果与分析  36-51    2.3.1 脂肪酶突变基因的制备  36-37    2.3.2 脂肪酶突变基因表达载体的选择  37    2.3.3 基因突变库的获得  37-38    2.3.4 突变脂肪酶表达载体电击转化巴斯德毕赤酵母GS115  38-40      2.3.4.1 线性化位点选择  38-39      2.3.4.2 电击转化毕赤酵母GS115  39-40    2.3.5 酵母转化子的初筛  40-41    2.3.6 酵母转化子的复筛  41-42    2.3.7 酶学性质初步分析  42-51      2.3.7.1 野生型脂肪酶GS-PEL的酶学性质  42-43      2.3.7.2 突变体GS-ep25-PEL的酶学性质  43-45      2.3.7.3 突变体GS-ep10-PEL的酶学性质  45-46      2.3.7.4 突变体GS-ep33-PEL的酶学性质  46-48      2.3.7.5 突变体GS-ep43-PEL的酶学性质  48-49      2.3.7.6 突变体GS-ep51-PEL的酶学性质  49-50      2.3.7.7 突变体GS-ep81-PEL的酶学性质  50-51  2.4 小结  51-54第三章 突变脂肪酶基因的克隆与测序  54-68  3.1 引言  54  3.2 材料与方法  54-57    3.2.1 实验材料  54-55      3.2.1.1 菌种和质粒  54      3.2.1.2 酶和实验药品  54      3.2.1.3 常用仪器  54-55      3.2.1.4 培养基及试剂  55      3.2.1.5 引物  55    3.2.2 实验方法  55-57      3.2.2.1 酵母基因组简易提取  55-56      3.2.2.2 突变脂肪酶基因的获得  56      3.2.2.3 构建表达载体及转化  56      3.2.2.4 阳性克隆子检测及目的片段测序  56-57  3.3 结果与分析  57-64    3.3.1 脂肪酶突变基因克隆  57-58    3.3.2 表达载体转化及重组子验证  58    3.3.3 突变脂肪酶序列分析  58-64      3.3.3.1 突变脂肪酶GS-ep25-PEL  58-60      3.3.3.2 突变脂肪酶GS-ep10-PEL  60-61      3.3.3.3 突变脂肪酶GS-ep33-PEL  61-62      3.3.3.4 突变脂肪酶GS-ep43-PEL  62-64  3.4 小结与讨论  64-68第四章 小结与展望  68-70参考文献  70-78攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  78-80致谢  80-82个人简历  82-83

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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