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凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶分离纯化与酶学特性研究

作　者: 庄志凯
导　师: 吉宏武
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产品加工及贮藏工程
关键词: 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶分离纯化酶学特性同源性分析
分类号: S985.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

虾头是去头虾、虾仁等产品加工过程中的副产物,全国年产虾头约20万吨,其中凡纳滨对虾虾头占70%。虾头不仅含有丰富的蛋白质等营养成分,还含有丰富的内源蛋白酶,这些蛋白酶在一定条件易导致虾头发生自溶作用,造成虾头腐烂变质,致使虾头得不到高值化利用,这不仅造成了资源的浪费,而且带来了严重的环境污染。为了深刻认识虾头内源酶的特性,有效保持虾头贮藏过程中的品质,充分利用虾头内源蛋白酶廉价回收虾头蛋白等营养成分提供基础数据,本论文首先研究了虾头内源蛋白酶活性随pH的变化规律,确定了虾头中存在两类内源性蛋白酶,其最适pH分别为2.0和8.0,在此基础对两类内源性蛋白酶的提取纯化和酶学特性进行了系统研究,并采用液相-质谱联用技术对这两种蛋白酶的同源性进行了初步分析,主要研究结果如下:1、以温度、pH和料液比等单因素对凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶活性影响结果为基础,采用正交实验对凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶最佳提取工艺条件进行了优化,并对两类内源蛋白酶硫酸铵分级沉淀的最佳饱和度进行了研究。结果表明:酸性蛋白酶最佳提取条件为缓冲溶液pH3.0,料液比1:2,温度30℃。酸性蛋白酶硫酸铵一级沉淀的饱和度为10%,硫酸铵二级沉淀饱和度为50%;碱性蛋白酶最佳提取条件为缓冲溶液pH8.0,料液比1:3,温度50℃。碱性蛋白酶硫酸铵一级沉淀饱和度为20%,硫酸铵二级沉淀饱和度80%。2、采用Q- Sepharose F. F阴离子交换层析和Sephadex G-150凝胶过滤层对凡纳滨对虾虾头内源碱性蛋白酶进行了纯化,并用SDS-PAGE对纯度与分子量进行了评价。结果表明,纯化后的碱性蛋白酶比活为1386.16U/mg,纯化倍数达到了26.50,得率为32.8%,分子量为79.95kDa。3、采用Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析对凡纳缤对虾虾头内源酸性蛋白酶进行了纯化,并用SDS-PAGE对纯度与分子量进行了评价。结果表明,纯化得到电泳纯级的内源酸性蛋白酶,其比活为698.09U/mg,纯化倍数达到15.7倍,得率为20.20%,分子量为27.45kDa。4、凡纳缤对虾虾头内源碱性蛋白酶酶学特性研究结果表明,该酶最适pH和最适温度分别为8.0和50℃,热稳性定较好,动力学参数Km和Vmax值分别为2.54g/L和7.11μg/min,金属离子Fe³⁺、Mn²⁺、Hg⁺,TryPsin inhibitor均能完全抑制其活性,DTT对其有激活作用,该蛋白酶属于胰蛋白酶酶类。5、凡纳缤对虾虾头内源酸性蛋白酶酶学特性研究结果表明,该酶最适pH和最适温度分别为3.0和30℃,热稳定性和pH稳定性均较差,动力学参数Km和Vmax值分别为2.01g/L和26.39μg/min,金属离子Hg⁺,Pepstatin A和EDTA均能完全抑制其活性,Ca²⁺对其有激活作用,该酶属金属蛋白酶,性质类似于胃蛋白酶类。6、采用分子荧光法和傅里叶红外光谱法研究了凡纳缤对虾虾头两类内源蛋白酶空间构象特性,结果表明,在λex = 278nm和295nm为激发波长条件下,内源碱性蛋白酶随着pH和离子强度的增大荧光强度上升,但荧光发射峰的位置并未发生移动,不过内源酸性蛋白酶二级结构发生了改变。在红外光谱扫描范围为900-1700cm-1,分辨率为为4cm-1条件下,两种内源性蛋白酶红外光谱都呈现出α-螺旋和β-折叠的特征,但两类蛋白酶谱带数据有所差异。7、利用LC-ESI-MS/MS对凡纳滨对虾虾头两类内源性蛋白酶同源类进行了初步分析,将检测到两种内源性蛋白酶的部分氨基酸序列分别与不同物种的胰蛋白酶和胃蛋白酶氨基酸序列于Vector NTI suite 8.0软件上进行序列比对,结果表明,发现凡纳滨对虾虾头内源碱性蛋白酶与猪的胰蛋白酶具有很高的同源性,均含有氨基酸序列LSSPATLNSRVATVSLPR;凡纳滨对虾虾头内源酸性蛋白酶与非洲蟾蜍的胃亚蛋白酶具有很高的同源性,均含有氨基酸序列EFGLSETEPGTNF。

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摘要 6-8Abstract 8-141 绪论 14-26 1.1 凡纳滨对虾及虾头利用资源 14-16 1.1.1 凡纳滨对虾的特性 14-15 1.1.2 凡纳滨对虾的加工利用 15 1.1.3 凡纳滨对虾虾头的结构特点和生化特性 15-16 1.2 凡纳滨对虾虾头中酶的种类 16-18 1.2.1 多酚氧化酶 16 1.2.2 几丁质酶 16 1.2.3 内源性蛋白酶 16 1.2.4 内源性蛋白酶的分类 16-18 1.3 酶的提取及分离纯化 18-20 1.3.1 蛋白酶的分离技术 18-20 1.4 酶学特性的研究 20-21 1.4.1 影响酶活性的各种因素 20-21 1.4.2 动力学方程 21 1.5 蛋白质结构的研究 21-24 1.5.1 研究蛋白质结构的方法 22-23 1.5.2 蛋白质结构的鉴定 23-24 1.6 本课题的立项依据及目的意义 24-25 1.6.1 立项依据 24 1.6.2 目的意义 24-25 1.7 主要研究内容 25-262 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶提取工艺的研究 26-38 2.1 前言 26 2.2 材料与方法 26-30 2.2.1 实验材料与试剂 26 2.2.2 实验仪器与设备 26-27 2.2.3 实验方法 27-29 2.2.4 单因素实验 29 2.2.5 正交实验 29-30 2.2.6 NaCl 浓度对虾头粗酶液中内源蛋白酶活力的影响 30 2.2.7 数据处理 30 2.3 结果与分析 30-36 2.3.1 pH 对虾头粗酶液中内源蛋白酶活力的影响 30-31 2.3.2 温度对虾头粗酶液中内源蛋白酶酶活力的影响 31-32 2.3.3 料液比对虾头内源蛋白酶酶活的影响 32-33 2.3.4 正交实验 33-35 2.3.5 NaCl 浓度对虾头内源蛋白酶活力的影响 35-36 2.4 本章小结 36-383 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶的分离纯化 38-51 3.1 前言 38 3.2 材料与方法 38-41 3.2.1 实验材料与试剂 38 3.2.2 实验仪器与设备 38-39 3.2.3 实验方法 39-41 3.3 结果与讨论 41-50 3.3.1 凡纳滨对虾虾头内源碱性蛋白酶的分离纯化 41-45 3.3.2 凡纳滨对虾虾头内源酸性蛋白酶的分离纯化 45-50 3.4 本章小结 50-514 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶的酶学特性 51-67 4.1 前言 51 4.1.1 米氏方程 51 4.1.2 Km 和Vmax 的意义 51 4.2 材料与方法 51-53 4.2.1 实验材料与试剂 51 4.2.2 实验仪器与设备 51-52 4.2.3 实验方法 52-53 4.3 结果与分析 53-65 4.3.1 凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶酶学特性 53-65 4.4 本章小结 65-675 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶结构的初步鉴定 67-83 5.1 前言 67 5.2 材料与方法 67-69 5.2.1 实验材料 67-68 5.2.2 主要仪器设备 68 5.2.3 实验方法 68-69 5.3 结果与分析 69-82 5.3.1 pH 和离子浓度对虾头内源蛋白酶荧光光谱的测定 69-72 5.3.2 pH 和离子强度对内源蛋白酶作用的红外光谱 72-75 5.3.3 内源性蛋白酶的同源性分析 75-82 5.4 本章小结 82-836 结论与展望 83-86 6.1 总结论 83-84 6.2 本论文的主要创新点 84 6.3 展望 84-86参考文献 86-96致谢 96-97作者简介 97-98导师简介 98

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