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大豆过氧化物酶的定向进化

作　者: 郑群
导　师: 曾家豫; 廖世奇
学　校: 西北师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 大豆过氧化物酶融合表达易错PCR 随机突变基因文库高效筛选酶定向进化
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

大豆过氧化物酶（soybean peroxidase, SBP）属于Ⅲ类过氧化物酶（EC1.11.117），与同类过氧化物酶相比具有底物作用范围广、耐热性能高、酸碱稳定性好、无污染、安全系数高、来源容易等优点。目前，SBP在食品加工、生物医学检测、工业废水处理及高分子材料合成等领域有着广泛的应用前景。同时，作为天然酶蛋白，其催化效率、底物亲合性、稳定性等酶学性质均有待进一步提高。本论文利用定向进化技术，将基因突变和高通量筛选相结合对大豆过氧化物酶进行改造，拟提高其催化效率，以更好地适应工业应用要求。其中，易错PCR以其操作简便、有效等优点成为目前应用最为广泛的进化手段之一。主要研究内容和成果如下：1.利用Invitrogen Corporation提供的Pichia pastoris表达系统，采用电转化方法将重组质粒pPICZα-A-sbp转化到宿主细胞Pichia pastoris GS115中，并在甲醇诱导下成功地分泌表达了大豆过氧化物酶基因（sbp），获得了具有生物活性的SBP。为了使sbp在毕赤酵母中获得尽可能高的表达，实验分别在不同接种量、不同甲醇诱导浓度、不同pH和不同诱导时间等方面进行了初步对比研究，得到了一套较完善的Pichia pastoris GS115重组菌株表达sbp的优化条件：接种量100ml/100ml、甲醇添加量0.75%、诱导培养基pH6.0、诱导时间48h。此时SBP酶活性为19.7U·ml^-1。为有效筛选出高催化活性SBP突变体奠定基础，并为今后发酵罐中SBP的大规模生产提供参考。2.为提高大豆过氧化物酶的活性及研究该酶一级结构与酶活性间的关系，采用连续易错PCR方法对sbp进行了2轮随机突变，将第二轮易错PCR产物与质粒载体pPICZα-A分别进行双酶切，经T₄DNA连接酶催化连接后，CaCl₂法转化重组质粒pPICZα-A-sbp至大肠杆菌DH5α中，成功构建出sbp随机突变文库，库容量约为1.77×10⁶cfu。3.突变基因文库构建完成以后，如何从突变基因文库中高效筛选出有益突变体成为酶体外定向进化试验成功与否的关键。本实验采用微孔板筛选法大大地提高了样品处理速度，增加了筛选的通量，节约了筛选时间。截至到目前，已筛选重组酵母576株，尚未发现催化活性有显著提高的SBP突变株。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
第一章绪论  10-30
  1 大豆过氧化物酶的研究进展  10-16
    1.1 大豆过氧化物酶的结构特征  10-13
    1.2 SBP 的作用机制  13-14
    1.3 SBP 的应用  14-16
    1.4 SBP 的研究现状  16
  2 蛋白酶的定向分子进化  16-24
    2.1 分子定向进化文库的构建  17-20
    2.2 分子定向进化文库的筛选  20-22
    2.3 分子定向进化的应用  22-24
  参考文献  24-30
第二章 sbp 在 Pichia pasoris GS115 中的表达及表达条件的优化  30-45
  2.1 试剂与仪器  30-32
    2.1.1 试剂及工具酶  30
    2.1.2 菌株  30
    2.1.3 仪器  30-31
    2.1.4 试剂配制  31-32
  2.2 方法  32-36
    2.2.1 pPICZα -A-sbp 重组质粒的线性化反应  32-33
    2.2.2 pPICZα -A-sbp 重组质粒转化 Pichia pastoris GS115  33-34
    2.2.3 阳性 Pichia pastoris GS115 转化子的保存  34
    2.2.4 阳性 Pichia pastoris GS115 转化子的鉴定  34-35
    2.2.5 sbp 在 Pichia pastoris GS115 中的表达  35
    2.2.6 粗酶液的活性检测  35
    2.2.7 Pichia pastoris GS115 重组菌株表达 SBP 条件优化研究  35-36
  2.3 结果与分析  36-42
    2.3.1 pPICZα -A-sbp 重组质粒的线性化  36-37
    2.3.2 pPICZα -A-sbp 重组质粒转化 Pichia pastoris GS115  37-38
    2.3.3 阳性 Pichia pastoris GS115 转化子的 PCR 分析检测  38-39
    2.3.4 sbp 在 Pichia pastoris GS115 中的表达  39-40
    2.3.5 Pichia pastoris GS115 重组菌株表达 SBP 条件优化结果  40-42
  2.4 讨论  42-43
  参考文献  43-45
第三章大豆过氧化物酶基因随机突变文库的构建  45-62
  3.1 材料  45-47
    3.1.1 菌株和质粒  45
    3.1.2 试剂及工具酶  45
    3.1.3 培养基及试剂的配制  45-46
    3.1.4 仪器  46-47
  3.2 方法  47-54
    3.2.1 引物设计  47
    3.2.2 易错 PCR 条件的优化  47-48
    3.2.3 sbp 的易错 PCR  48-50
    3.2.4 目的基因与 pPICZα -A 的双酶切  50
    3.2.5 目的基因与 pPICZα -A 的连接反应  50-52
    3.2.6 pPICZα -A-sbp 重组质粒转化 E.coli DH5α  52-53
    3.2.7 E.coli DH5α阳性转化子中 pPICZα -A-sbp 重组质粒的鉴定  53-54
    3.2.8 sbp 随机突变文库的鉴定  54
  3.3 结果与分析  54-60
    3.3.1 易错 PCR 条件的优化  54-55
    3.3.2 sbp 的易错 PCR 反应  55
    3.3.3 目的基因与 pPICZα -A 的双酶切  55-56
    3.3.4 目的基因与 pPICZα -A 的连接反应  56-57
    3.3.5 pPICZα -A-sbp 重组质粒转化 E.coli DH5α  57
    3.3.6 E.coli DH5α阳性转化子中 pPICZα -A-sbp 重组质粒的鉴定  57-58
    3.3.7 随机突变文库的鉴定  58-60
  3.4 讨论  60-61
  参考文献  61-62
第四章高催化活性大豆过氧化物酶突变菌株的筛选  62-69
  4.1 试剂与仪器  62-64
    4.1.1 试剂及工具酶  62
    4.1.2 菌株  62
    4.1.3 仪器  62-63
    4.1.4 试剂配制  63-64
  4.2 方法  64-65
    4.2.1 突变文库转化 Pichia pastoris GS115  64-65
    4.2.2 筛选方法的初步建立  65
  4.3 结果与分析  65-67
    4.3.1 突变文库的线性化反应  65-66
    4.3.2 突变文库转化 Pichia pastoris GS115  66
    4.3.3 Pichia pastoris GS115 阳性转化子的鉴定  66-67
    4.3.4 高催化活性大豆过氧化物酶突变体的筛选  67
  4.4 讨论  67-68
  参考文献  68-69
附录：硕士期间发表的论文及参与的科研项目  69-70
致谢  70

大豆过氧化物酶的定向进化

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