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易错PCR介导扩展青霉脂肪酶定向进化

作　者: 陈彦
导　师: 林琳
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物
关键词: 扩展青霉脂肪酶 易错PCR 最适作用温度 酶活 热稳定性
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究利用易错PCR技术对扩展青霉脂肪酶PEL进行定向进化。以扩展青酶脂肪酶基因为模板,通过易错PCR和转化毕赤酵母建立了约含13000个突变株的突变体库；通过酶活性的平板透明圈高通量的筛选获得了约50株的有活性的转化子；通过酶学特性分析和基因克隆测序,筛选出如下热稳定性和酶活有所改变的突变体。(1)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER04,其最适作用温度比野生型提高10℃,在最适作用温度下的酶活提高了约22%,Tm值比野生型提高了3.28℃。(2)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER10最适作用温度比野生型提高了5℃,在最适作用温度下的酶活为950U/mL, Tm值比野生型提高了2.15℃。(3)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER15的最适作用温度没有发生变化,在最适作用温度下的酶活为935U/mL, Tm值比野生型提高了2.28℃。(4)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER17最适作用温度比野生型提高了5℃,在最适作用温度下的酶活为1005U/mL, Tm值比野生型提高了1.8℃。(5)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER31最适作用温度比野生型提高了5℃,在最适作用温度下的酶活为917U/mL, Tm值比野生型提高了2.25℃。(6)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER38的最适作用温度没有发生变化,在最适作用温度下的酶活为1105U/mL, Tm值比野生型提高了2.81℃。(7)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER45的最适作用温度未发生变化,在最适作用温度下的酶活为1060U/mL, Tm值比野生型提高了2.26℃。(8)突变体GS-pPIC3.5K-lip07-ER50的最适作用温度未发生变化,在最适作用温度下的酶活为425U/mL,降低了约42%,Tm值40.4℃。(9)突变体HR1、HR2、HR5的最适温度最适作用温度未发生变化,在最适作用温度下的酶活分别为720U/mL、612U/mL、762U/mL,变化并不明显。本研究共筛选出十一个突变体,其中七个热稳定性和酶活得以提高的正向突变体,结果说明易错PCR介导的定向突变是种很好的酶分子改造的手段,这些突变体的获得为进一步的脂肪酶定向进化打下了基础。

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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