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家蚕中一个新的膜蛋白基因HW的融合表达和纯化

作　者: 张雅凝
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 膜蛋白 HW基因 多角体融合表达 Bac-to-Bac系统 RNAi
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


从实验室的膜蛋白库中筛选出一个膜蛋白,通过分析预测这个蛋白有三个跨膜区,为一个未知功能的膜蛋白,将其命名为HW。生物信息学分析发现,HW基因cDNA全长1230 bp,开放阅读框（ORF）大小为294 bp,编码97个氨基酸残基,预测分子量大小约为10.93 kD。基于膜蛋白难表达的问题,本课题利用多角体融合表达分别在大肠杆菌和家蚕细胞中表达该膜蛋白基因。根据HW基因cDNA序列的ORF框设计一对特异引物,PCR扩增出目的基因,克隆到本实验室构建的融合多角体基因的载体pBacPAK8-Ph获得重组载体pBacPAK8-Ph-HW,该载体可以将HW基因与多角体基因融合,两者之间插入TEV酶基因序列,便于HW膜蛋白与多角体蛋白的分离。双酶切pBacPAK8-Ph-HW载体获得Ph-HW片段,克隆到pET-28a（+）相同酶切位点获得重组原核表达载体pET-28a（+）-Ph-HW,将构建的重组表达载体转化BL21（DE3）E. coli感受态细胞,经PCR、BamHⅠ/NotⅠ酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。采用终浓度为1 mM的IPTG、28℃条件下诱导重组蛋白表达,裂解菌体SDS-PAGE分析发现有大小约40 kD的目的条带。利用亲和层析方法纯化融合蛋白后,TEV酶酶切得到膜蛋白HW。家蚕细胞表达该目的蛋白,根据Bac-to-Bac系统,将上述获得的HW与多角体融合基因Ph-HW片段插入到pFastBacTMHTB载体构建重组转移载体pFastBac-Ph-HW,将pFastBac-Ph-HW重组载体转化E. coli DH10BacTM感受态细胞。重组pFastBac-Ph-HW载体与穿梭载体bacmid发生同源重组,获得重组bacmid杆粒。重组成功的bacmid转染家蚕细胞,收集重组杆状病毒继续感染家蚕细胞,三次感染细胞后的重组杆状病毒用来大量感染家蚕正常细胞,收集感染的细胞进行SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明多角体融合的家蚕HW基因在家蚕细胞中成功表达。家蚕细胞中HW基因的RNAi实验表明该基因对家蚕细胞的存活有一定的作用,在纯化基础上探究HW蛋白的结晶,初步得到家蚕膜蛋白HW的粗结晶,这些为进一步探究HW膜蛋白的结构和功能奠定了基础。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-15
缩略语  15-16
第一部分 文献综述与实验设计  16-25
  第一章 文献综述  16-23
    1. 前言  16-17
    2. 膜蛋白HW 的相关信息  17-18
    3. 关于多角体  18
    4. 原核表达系统  18-19
    5. 新的Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统  19
    6. 家蚕生物反应器的应用  19-20
    7. 膜蛋白的纯化方法  20-21
    8. 膜蛋白HW 的结构功能分析  21-23
  第二章 实验设计方案  23-25
    1. 实验目的和意义  23
    2. 本实验的主要研究内容  23-24
    3. 实验技术路线  24-25
第二部分 研究论文  25-86
  第一章 生物信息学分析  25-31
    1. 生物信息学工具  25-26
    2. 分析方法  26-27
      2.1 目的基因HW 的获得  26
      2.2 利用生物信息学方法分析  26-27
    3. 分析结果  27-30
      3.1 家蚕膜蛋白HW 的基因序列  27
      3.2 保守性分析  27-28
      3.3 膜蛋白HW 的疏水性分析  28
      3.4 膜蛋白HW 的跨膜区分析  28-29
      3.5 信号肽预测  29-30
      3.6 膜蛋白HW 的亚细胞定位分析  30
    4. 讨论  30-31
  第二章 家蚕HW 基因的原核表达  31-49
    1. 材料与试剂  31-35
      1.1 材料  31
      1.2 订购试剂  31-32
      1.3 自配试剂  32-35
    2. 方法  35-43
      2.1 HW 基因的克隆  35-39
        2.1.1 特异性引物的设计与合成  36
        2.1.2 PCR 扩增  36-37
        2.1.3 PCR 产物和pBacPAK8-Ph 载体的双酶切和回收  37
        2.1.4 连接反应  37
        2.1.5 CaCl_2法制备E.coli TG1 感受态细胞  37-38
        2.1.6 连接产物的转化  38
        2.1.7 重组pBacPAK8 质粒的筛选与鉴定  38-39
      2.2 融合基因Ph-HW 的克隆  39-40
        2.2.1 融合基因Ph-HW 的回收  39
        2.2.2 pET-28a 载体双酶切与回收  39
        2.2.3 融合基因与pET-28a 载体的连接和转化  39-40
        2.2.4 重组质粒pET-28a-Ph-HW 的筛选与鉴定  40
      2.3 融合基因Ph-HW 的表达  40-43
        2.3.1 CaCl_2法制备E.coli BL21 感受态细胞  40
        2.3.2 重组质粒pET-28a-Ph-HW 的筛选  40
        2.3.3 His-Ph-HW 融合蛋白在大肠杆菌中的表达  40-41
        2.3.4 蛋白凝胶电泳检测  41-42
        2.3.5 Western blot鉴定  42-43
    3. 结果  43-47
      3.1 PCR 扩增目的基因  43-44
      3.2 HW 基因PCR 产物双酶切回收与载体pBacPAK8-Ph 的双酶切回收  44
      3.3 重组质粒pBacPAK8-Ph-HW 的鉴定  44-45
      3.4 融合基因Ph-HW 的双酶切回收与载体pET-28a 的双酶切回收  45
      3.5 重组质粒pET-28a-Ph-HW 的鉴定  45-46
      3.6 His-Ph-HW 融合蛋白的表达  46-47
        3.6.1 SDS-PAGE 电泳检测  46-47
        3.6.2 Western blot 检测  47
    4. 讨论  47-49
  第三章 家蚕融合膜蛋白的纯化与性质分析  49-59
    1. 材料与试剂  49-51
      1.1 材料  49
      1.2 试剂  49
      1.3 主要试剂的配制  49-51
        1.3.1 包涵体洗涤用试剂  49-50
        1.3.2 调pH 值的方法纯化融合蛋白所用试剂  50
        1.3.3 镍柱亲和层析纯化用试剂  50
        1.3.4 SDS-PAGE 电泳用试剂  50-51
        1.3.5 Western blot 鉴定试剂的配置  51
    2. 方法  51-54
      2.1 融合蛋白表达产物存在形式的检测分析  51
      2.2 重组蛋白的大量表达与样品制备  51-52
      2.3 调pH 值的方法纯化融合蛋白  52-53
      2.4 Ni-NTA 柱纯化融合蛋白  53-54
        2.4.1 尿素溶解目的融合蛋白  53
        2.4.2 Ni-NTA 柱纯化融合蛋白  53-54
      2.5 融合蛋白TEV 酶切，去掉多角体  54
    3. 结果  54-58
      3.1 融合蛋白表达形式的确定  54-55
      3.2 调pH 方法纯化融合蛋白结果  55-56
        3.2.1 摸索最佳溶解缓冲液pH  55-56
        3.2.2 调pH 方法纯化结果  56
      3.3 镍柱亲和层析纯化融合蛋白结果  56-57
      3.4 目的蛋白HW 的获得  57-58
    4. 讨论  58-59
  第四章 家蚕HW 基因的真核表达  59-75
    1. 材料与试剂  59-61
      1.1 材料  59-60
      1.2 订购试剂  60
      1.3 自配试剂  60-61
    2. 方法  61-70
      2.1 Bac-to-Bac(?) System  61-62
      2.2 实验方案设计路线  62-63
      2.3 构建融合pFastBac~(TM)HTb 质粒  63-65
        2.3.1 pFastBac~(TM)HTb 质粒的提取  63
        2.3.2 pFastBac~(TM)HTb 质粒的双酶切与回收  63
        2.3.3 回收的融合基因与回收的质粒pFastBac~(TM)HTb 的连接反应  63-64
        2.3.4 E.coli TG1 感受态细胞的制备（如原核实验部分，略）  64
        2.3.5 连接产物的转化实验  64
        2.3.6 阳性克隆的筛选与鉴定  64-65
        2.3.7 重组质粒测序  65
      2.4 重组BmBacmid-Ph-HW 质粒的构建  65-68
        2.4.1 E. coli DH10Bac~(TM)感受态细胞的制备  65-66
        2.4.2 重组质粒pFast-Ph-HW 直接转化含有bacmid 质粒E. coli DH10Bac~(TM)感受态细胞  66
        2.4.3 重组BmBacmid-Ph-HW 质粒的提取  66-67
        2.4.4 BmBacmid-Ph-HW 重组质粒的鉴定（PCR 鉴定）  67-68
      2.5 BmBacmid-Ph-HW 重组质粒转染家蚕细胞  68
      2.6 收获重组病毒并继续感染家蚕细胞  68-70
        2.6.1 观察细胞发病情况  68-69
        2.6.2 第一次收集重组杆状病毒  69
        2.6.3 重组病毒基因组PCR 鉴定  69-70
        2.6.4 杆状病毒的扩大化  70
        2.6.5 融合基因在家蚕细胞中的表达鉴定  70
    3. 结果分析  70-74
      3.1 融合基因Ph-HW 的回收  70-71
      3.2 融合基因Ph-HW 与pFastBac~(TM)HTb 质粒的融合鉴定  71-72
      3.3 重组质粒pFastBac~(TM)HTb 测序结果  72
      3.4 重组质粒pFast-Ph-HW 与E. coli DH10Bac~(TM)中bacmid 质粒同源重组及鉴定  72-73
      3.5 重组病毒基因组的PCR 鉴定  73
      3.6 融合目的蛋白在家蚕细胞中表达的鉴定  73-74
    4. 讨论  74-75
  第五章 HW 基因的RNAi 对家蚕培养细胞生物活性的影响  75-81
    1. 材料与试剂  75-76
      1.1 材料  75
      1.2 试剂  75
      1.3 试剂的配制  75-76
    2. 方法  76-78
      2.1 dsRNA 的合成  76-77
        2.1.1 合成体外转录模板  76-77
        2.1.2 体外转录RNA  77
        2.1.3 dsRNA 浓度的测定  77
      2.2 RNAi----dsRNA 的转染  77-78
      2.3 MTT 检测细胞变化情况  78
    3. 结果  78-80
      3.1 dsRNA 的合成  78-79
      3.2 HW RNAi 的MTT 检测结果分析  79-80
    4. 讨论  80-81
  第六章 家蚕体内新膜蛋白HW 的结晶初探  81-86
    1. 材料和试剂  81
    2. 方法  81-83
      2.1 纯化HW 蛋白浓度的测定  81-82
      2.2 膜蛋白HW 的脱盐、浓缩  82
      2.3 盖玻片的硅化  82
      2.4 结晶试剂盒点蛋白样品  82-83
      2.5 观察样品结晶情况  83
    3. 结果  83-84
      3.1 纯化蛋白浓度测定  83
      3.2 纯化蛋白的脱盐浓缩  83-84
      3.3 蛋白的结晶分析  84
    4. 讨论  84-86
结论与创新点  86-87
参考文献  87-92
致谢  92

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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