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未培养微生物β-葡萄糖苷酶基因的新功能鉴定以及突变研究
作 者: 金科
导 师: 唐咸来
学 校: 广西大学
专 业: 微生物学
关键词: 脂肪酶 脂肪酶家族 易错PCR 突变体文库
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
bgl1D基因(Genbank登录号为FJ686869)是本实验室从宏基因组文库中筛选得到的一个编码β-葡萄糖苷酶活性的新基因资源。前期已经构建得到表达β-葡萄糖苷酶活性的重组菌株pGXAG801。该基因的生物信息学分析表明:在氨基酸水平上,Bgl1D基因编码蛋白与已知来自肉毒杆菌脂肪酶蛋白有31%的相似性,由此推测该Bgl1D基因除具有编码p-葡萄糖苷酶活性外,可能还具有编码脂肪酶活性的功能,其编码蛋白可能是一种兼职蛋白质。在核苷酸水平上,Bgl1D与已知数据库中的脂肪酶基因相似性很低。重组菌株pGXAG801编码目的蛋白纯化后,以PNPB为底物,对其进行了脂肪酶酶学性质的初步研究,得到以下结论:该蛋白的最适pH为9.0;最适温度为25℃;Km为0.54 mmol/L;Vmax为3.17μmol/min;最适条件下酶活为8.2 U/mg; Al3+、Li+、Cu2+离子对酶反应有激活作用,Fe2+、Fe3+离子有抑制作用。验证了该基因编码蛋白除具有β-葡萄糖苷酶活性外,同时还具备脂肪酶的活性。利用易错PCR技术,以bgl1D基因为模板构建突变体库,筛选得到一批克隆突变子,进行筛选后得到突变体pGXAG801-1和pGXAG801-2,对该突变酶纯化后验证酶活,发现β-葡萄糖苷酶和脂肪酶活性均降低,其中1号β-葡萄糖苷酶酶活为原始菌株的30%,脂肪酶为20%,测序表明该蛋白氨基酸序列有3个位点发生突变,2号菌株β-葡萄糖苷酶酶活为原始菌株的20%,脂肪酶酶活丧失。测序表明该蛋白氨基酸序列有6个位点氨基酸发生突变,由此分析推测突变处可能为该酶保守区域。基因bgl1D编码蛋白除具有β-葡萄糖苷酶催化活性外,还有脂肪酶催化功能,推测bgl1D基因有可能是一种新型编码脂肪酶的基因。通过突变体文库构建说明保守氨基酸序列对酶活的重要性,为进一部阐明催化机理打下坚实基础。
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全文目录
摘要 4-6 ABSTRACT 6-11 第一章 前言 11-30 1.1 绪论 11-12 1.2 酶的名称和系统 12-13 1.2.1 酶的命名 12-13 1.2.2 酶的分类 13 1.3 水解酶 13-16 1.3.1 水解酶介绍 13-14 1.3.2 酯键水解酶 14-16 1.4 多功能蛋白质 16-22 1.4.1 蛋白质序列、功能、结构和机制的一致性 16-18 1.4.2 双功能蛋白质(兼职蛋白质moonlighting proteins) 18-19 1.4.3 蛋白质催化混杂性(catalytic promiscuity) 19-20 1.4.4 多功能酶(multifunctional enzyme) 20-22 1.5 脂肪酶 22-28 1.5.1 脂肪酶的简介 22-23 1.5.3 脂肪酶催化反应的特异性 23-24 1.5.4 脂肪酶的分类 24-28 1.6 本论文的研究目的及实验方案 28-30 1.6.1 本论文的研究目的 28-29 1.6.2 本论文的实验方案 29-30 第二章 材料与方法 30-43 2.1 实验材料 30-33 2.1.1 文库来源 30 2.1.2 菌株、质粒和蛋白质 30-31 2.1.3 培养基、生长条件及抗生素 31 2.1.4 菌种保存 31-32 2.1.5 使用试剂 32 2.1.6 常规溶液、缓冲液 32 2.1.7 常规仪器 32-33 2.2 实验方法 33-43 2.2.1 试剂盒快速抽提质粒DNA 33 2.2.2 胶回收目地DNA片段 33-34 2.2.3 PCR产物纯化试剂盒纯化 34 2.2.4 DNA的酶切和连接 34-42 2.2.5 生物信息学分析方法 42-43 第三章 双功能酶基因的生物信息学分析和酶学验证 43-54 3.1 双功能酶编码基因的来源 43 3.2 生物信息学分析 43-44 3.2.1 核苷酸序列相似性检索 43 3.2.2 蛋白质氨基酸序列相似性检索 43-44 3.3 氨基酸序列的同源性比对 44-45 3.4 分子进化与系统发育分析 45-46 3.5 目标蛋白的酶学特性分析 46-53 3.5.1 最适PH值 47 3.5.2 最适反应温度 47-48 3.5.3 酶活单位 48 3.5.4 pH值耐受性分析 48-49 3.5.5 热稳定性分析 49-50 3.5.6 酶促动力学 50-51 3.5.7 金属离子对酶活力的影响 51-52 3.5.8 EDTA对酶活力的影响 52-53 3.5.9 酶的半衰期的测定 53 3.6 总结 53-54 第四章 突变体文库的构建及活性克隆的筛选、序列测定和结果分析 54-63 4.1 突变体构建的理论基础 54 4.2 突变体库的构建 54-57 4.2.1 双功能酶基因的易错PCR扩增 54-55 4.2.2 突变体重组质粒的构建和表达 55-57 4.3 原酶和突变酶酶学性质比较 57-60 4.3.1 酶反应的最适温度 58 4.3.2 酶反应的最适pH 58-59 4.3.3 酶的热稳定性的测定 59-60 4.4 突变酶和原酶的序列测序分析 60-63 第五章 总结、讨论与展望 63-68 5.1 总结 63 5.2 讨论 63-65 5.2.1 双功能蛋白(双功能酶)的分析 63-64 5.2.2 新型脂肪酶蛋白质家族的建立 64 5.2.3 突变位点的突变酶性质分析 64 5.2.4 作用机理 64-65 5.2.5 酶学特性 65 5.3 展望 65-68 5.3.1 双功能蛋白质的催化机理分析 65-66 5.3.2 酶的改造 66-67 5.3.3 人工酶 67-68 参考文献 68-74 致谢 74-75 攻读硕士学位期间发表的学术论文 75-76 附录 76-79
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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