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杏鲍菇（Pleurotus eryngii）漆酶基因的体外诱变及在毕赤酵母中表达

作　者: 蒋瑾
导　师: 吴坤
学　校: 河南农业大学
专　业: 微生物
关键词: 杏鲍菇 漆酶 体外诱变 易错PCR OE-PCR 毕赤酵母
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


漆酶属于铜蓝氧化酶,是一种重要的木质素降解酶,参与自然界木质素的循环和利用,同时漆酶对与木质素结构相似的许多环境污染物也有明显的降解能力,因此漆酶在环境保护、造纸工业、食品工业、及生物传感器、免疫检测等领域的重要性越来越明显。漆酶在自然界中主要是白腐菌产生的,但白腐菌产漆酶的能力较低,很难满足工业发酵的需求。杏鲍菇是从常见白腐菌中筛选出来的,其最适作用温度较高且热稳定性和pH值稳定性也比较好。本课题以杏鲍菇组成型漆酶的cDNA序列(GenBank序列号为FJ231091)为材料,即pMD19T-lac为模板,运用易错PCR和重叠延伸PCR对漆酶基因进行体外诱变,获得突变基因,并构建了重组克隆载体和重组表达载体,用于研究漆酶的异源表达情况,实现漆酶的高密度发酵和缩短漆酶的生产周期。为工业化生产打下良好的基础,并为将来对漆酶进行进一步分子改造以及快速定向进化奠定基础。论文共分三个部分。1.以来自杏鲍菇的漆酶基因(pMD19T-lac)为模板,采用易错PCR(error-prone PCR)对漆酶基因进行体外诱变,建立突变库,筛选突变基因,构建毕赤酵母表达系统,但未见活性表达。随机挑选突变体测序,结果表明,其中一个突变基因共有两个碱基发生了突变,均发生在T、C之间,其中第209位Val→Ala,另一个为第237位Pro的同义突变。这两个位点分别处于结构域1的1个β-折叠片和一段无规卷曲上,参与和T2/T3三核簇的连接。2.以易错PCR筛选到的突变体基因为模板,用叠延伸PCR法(OE-PCR)将GCC回复突变为高表达优越密码子GTC,即实现了Ala→Val。含突变位点的基因(lacM)与pMD19T-Simple Vector连接,构建为重组克隆载体pMD19-lacM。3.含突变位点的基因(lacM)与毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A连接,构建为重组表达载体pHBM905AM,线性化后电转化进毕赤酵母GS115,利用酿酒酵母α-factor作为信号肽,在GS115中诱导表达成功。虽检测到了酶活,但活性仍然不高。

全文目录


摘要  8-9第一部分 文献综述  9-23  1.1 漆酶  9-13    1.1.1 漆酶的简介  9    1.1.2 漆酶的研究进展  9-13      1.1.2.1 漆酶的结构特征  9-11      1.1.2.2 漆酶的理化性质  11      1.1.2.3 漆酶基因的克隆和表达  11-12      1.1.2.4 漆酶基因的体外诱变  12-13  1.2 体外诱变  13-19    1.2.1 体外诱变的研究进展  13-18      1.2.1.1 不依赖PCR 的体外诱变方法  13-14      1.2.1.2 依赖PCR 的体外诱变方法  14-18    1.2.2 体外诱变的选择策略  18-19  1.3 毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统  19-23    1.3.1 Pichia pastoris 表达系统的研究概况  19-21      1.3.1.1 宿主菌  19      1.3.1.2 载体  19-20      1.3.1.3 启动子  20-21      1.3.1.4 载体的整合  21    1.3.2 Pichia pastoris 表达系统的特点  21-22    1.3.3 Pichia pastoris 表达系统的应用  22    1.3.4 影响Pichia pastoris 中外源蛋白表达的因素  22-23      1.3.4.1 外源基因的内在特性  22      1.3.4.2 表达条件  22-23第二部分 引言  23-24第三部分 材料和方法  24-34  3.1 材料  24-26    3.1.1 菌株和质粒  24-25    3.1.2 试剂和药品  25    3.1.3 培养基  25-26    3.1.4 仪器设备  26  3.2 流程  26-27    3.2.1 重组载体的构建  26-27      3.2.1.1 重组克隆载体的构建  26      3.2.1.2 重组表达载体的构建  26-27    3.2.2 漆酶基因在毕赤酵母中的表达  27  3.3 方法  27-34    3.3.1 诱变PCR 体系的构建  27-28      3.3.1.1 PCR 引物设计  27      3.3.1.2 PCR 反应体系和循环条件  27-28    3.3.2 PCR 产物的纯化  28    3.3.3 重组载体的构建  28-31      3.3.3.1 pMD19-lacM 的构建  28-29      3.3.3.2 pHBM905AM 的构建  29-31    3.3.4 质粒的提取  31    3.3.5 感受态细胞的制备  31-32      3.3.5.1 使用CaC12 法制备大肠杆菌感受态细胞  31      3.3.5.2 使用山梨醇制备毕赤酵母感受态细胞  31-32    3.3.6 转化  32      3.3.6.1 CaC12 法转化大肠杆菌  32      3.3.6.2 电转化法转化毕赤酵母  32    3.3.7 阳性转化子的筛选  32      3.3.7.1 大肠杆菌阳性转化子的筛选  32      3.3.7.2 重组毕赤酵母的PCR 鉴定  32    3.3.8 毕赤酵母基因组DNA 的提取  32-33    3.3.9 漆酶在毕赤酵母中的高密度诱导表达  33    3.3.10 酶活力测定  33    3.3.11 异丙醇沉降法  33-34第四部分 结果与分析  34-40  4.1 体外诱变结果  34-37    4.1.1 易错PCR 结果  34-35      4.1.1.1 易错PCR 条件的确定  34      4.1.1.2 易错PCR 测序分析  34-35    4.1.2 OE-PCR 结果  35-37      4.1.2.1 OE-PCR 扩增产物  35-36      4.1.2.2 OE-PCR 测序结果  36-37  4.2 重组表达载体的构建及鉴定  37-38  4.3 重组毕赤酵母的鉴定  38  4.4 重组毕赤酵母的高密度诱导表达及SDS-PAGE 分析  38-40第五部分 结论和讨论  40-42  5.1 结论  40  5.2 讨论  40-42    5.2.1 易错PCR  40    5.2.2 表达载体的优势和通用性  40-41    5.2.3 展望  41-42参考文献  42-49英文摘要  49-50

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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