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猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别诊断方法建立及四川分离株全基因文库的构建分析

作　者: 漆信桥
导　师: 徐志文；郭万柱
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定 RT-PCR 全基因文库遗传变异生物信息学分析
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 32次
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起。自1987年报道该病以来,该病在全球养猪国家迅速蔓延开。1991年,荷兰科学家用猪肺泡细胞培养病毒获得成功。同年,我国台湾地区首次报道该病的发生,1995年我国大陆地区也报道该病的发生,并于1996年分离得到该病病原,同时确诊为美洲型PRRSV感染；2006年,我国部分地方又出现了以高发病率、高死亡率为特征的“高热综合征”,经病原学调查分析,发现是变异PRRSV感染所致,给我国养猪业带来了巨大的经济损失。本研究通过建立鉴别诊断普通与变异PRRSV的鉴别诊断方法,为该病的防控提供有效的技术手段。同时通过构建PRRSV SCS株的基因组文库并进行生物信息学分析,为研究该病毒的遗传变异与致病力之间的关系奠定基础。整个研究初步取得了一下研究结果：1.利用DNAstar软件,通过序列比较分析普通与变异PRRSV NSP2之间的序列差异,针对不同的保守区域设计3条特异性检测引物,成功建立能够同时检测PRRSV普通株与变异株的RT-PCR方法。并用建立的方法对四川各地送检的100分样品进行检测,结果检出变异PRRSV 26份,普通PRRSV 8份,阳性率分别为26%和8%。2.对不同地区分离得到的PRRSV进行序列测定构建其基因组文库对于探讨病毒的变异规律及病毒结构与功能之间的关系显得尤为重要,生物学特性和致病性的差异往往是因为病毒结构变化引起,而病毒结构又决定于基因组差异。通过序列比对,参照GenBank收录的PRRSV完整基因组(Accession Number:NC 006151)序列,在保守区域设计5对引物,用于PRRSV SCS株基因组序列克隆,同时采用cDNA末端快速扩增方法获取5’和3’末端序列,进而获得PRRSVSCS株全基因组序列。为了更进一步分析国内PRRSV不同地区之间的遗传特性打下基础。3.通过生物信息学方法比较分析四川分离PRRSV SCS株与NCBI下载的不同地区的PRRSV之间的遗传进化关系,通过密码子使用情况分析研究其变异规律。结果显示,将本次实验得到的PRRSV SCS基因组的序列,与NCBI上下载的11株PRRSV基因序列,核苷酸同源性在49.1%-98.5%。从遗传进化树上看,12株病毒分为了两个大群,AY366525、DQ864705、DQ489311为一个大群,其余9个毒株为一个大群。其中,本次试验获得的PRRSV SCS基因组序列与EF641008、GQ499196的同源性最高,而EF641008、GQ499196两个分离株均为江西株,说明四川流行的PRRSV毒株与江西株亲缘关系更进。通过应用对应分析的方法对PRRSV遗传密码子得分析,以期找出其变异规律。密码子的聚类分析发现同一亚型的PRRSV基因具有相近的同义密码子使用偏性。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
缩略词表  9-11
目录  11-13
第一章文献综述  13-21
  1 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展  13-20
    1.1 PRRSV概述  13
    1.2 PRRSV病原学特性  13-14
    1.3 PRRSV病毒基因组结构  14
    1.4 PRRSV主要编码蛋白  14-17
    1.5 PRRSV诊断方法研究进展  17-18
    1.6 PRRSV免疫学研究进展  18-19
    1.7 PRRSV疫苗研究进展  19-20
  2 生物信息学的研究应用  20-21
第二章 PRRSV普通株与变异株鉴别诊断方法建立  21-30
  1 材料与方法  21-25
    1.1 主要材料与试剂  21-22
    1.2 方法  22-25
  2 结果  25-28
    2.1 PCR反应体系及引物和温度优化  25
    2.2 RT-PCR产物鉴定  25
    2.3 特异性试验  25
    2.4 敏感性试验  25-27
    2.5 重复性试验  27
    2.6 临床样品检测  27-28
  3 讨论  28-30
第三章 PRRSV SCS株基因组文库构建  30-41
  1 材料与方法  30-39
    1.1 主要材料与试剂  30-32
    1.2 方法  32-39
  2 结果  39-40
    2.1 PRRSV SCS株全基因组扩增结果  39-40
    2.2 全基因组片段克隆及序列拼接  40
  3 讨论  40-41
第四章 PRRSV SCS株基因序列分析  41-57
  1 材料与方法  42-44
    1.1 材料  42
    1.2 方法  42-44
  2 结果  44-54
    2.1 PRRSV基因核苷酸序列同源性分析  44-45
    2.2 PRRSV基因核苷酸序列遗传进化树分析  45-46
    2.3 PRRSV密码子使用分析结果  46-47
    2.4 PRRSV密码子对应分析统计结果  47-49
    2.5 PRRSV密码子聚类分析结果  49-50
    2.6 PRRSV GP5序列分析结果  50-54
  3 讨论  54-57
全文总结  57-58
参考文献  58-64
致谢  64-65
攻读学位期间发表或参与发表的文章  65-66
附录一  66-73

猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别诊断方法建立及四川分离株全基因文库的构建分析

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