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苏云金芽孢杆菌S2160-1中cry30Ga2基因的鉴定和克隆

作　者: 田亮
导　师: 方宣钧
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: 苏云金芽孢杆菌 PCR-RFLP 构建基因文库 SON-PCR
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究利用PCR-RFLP方法鉴定了苏云金芽孢杆菌Bt S2160-1菌株含有新型cry30毒素基因。我们先后通过构建Bt S2160-1质粒文库和单链寡核苷酸巢氏PCR(single-oligonucleotide nested-PCR简称SON-PCR)方法,克隆该cry30基因。我们先后构建了Bt S2160-1的3个质粒DNA文库,最小的文库包含了1800个克隆子。提取了菌株S2160-1的质粒DNA,用BamHⅠ和BglⅡ酶切,将获得的酶切产物与用BamHⅠ酶切的载体pBU4体外连接,然后转化到宿主细胞大肠杆菌E.coli. JM110,利用蓝白斑法筛选含重组质粒的大肠杆菌,并采用PCR-RFLP的方法快速检测。我们筛选了5个PCR检测为阳性的克隆子,经过酶切验证送去测序,测序失败。通过构建基因文库我们并未获得cry30的全长序列。我们推测基因两端为插入序列,形成高级结构。我们采用了单链寡核苷酸巢氏PCR(SON-PCR)来克隆cru30基因。以菌株S2160-1质粒为模板,以cry30基因家族通用引物进行PCR扩增,扩增的片段进行亚克隆,测序。我们根据获得的部分序列设计了上下游引物,以Bt菌株S2160-1的质粒DNA为模板,利用扩增侧翼序列的单链寡核苷酸巢氏PCR进行扩增。扩增的产物进行亚克隆,筛选的阳性克隆子进行测序。利用DNAstar软件将已知片段和SON-PCR获得的上下游序列进行拼接,获得了含有cry30基因的全长序列。通过NCBI站点的blastx程序比对,发现该基因为一新的毒素基因。与cry30Ga1毒素序列一致性大于95%。GenBank登录号：HQ638217；序列提交Bt国际命名委员会命名为"cry30Ga2"。我们设计并合成了扩增基因全长的引物,利用PCR的方法获得了全长序列,构建了表达载体,转化E.coli. BL21(DE3)进行表达。利用SDS-PAGE分析,结果表明,重组子E.coli. BL21(DE3)-30Ga2并未表达74kDa蛋白。E.coli. BL21(DE3)-30Ga2进行测序验证,结果表明插入的序列并未发生突变。氨基酸同源序列的比对显示其可能具有杀蚊活性,新杀虫基因的克隆为研发新一代生物杀虫剂提供了资源；新基因的克隆使毒素基因库更加丰富和多样,为转基因植物的研究提供了新的基因资源。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-10
第一章 前言  10-21
  1.1 Bt的生物学特征  10-11
  1.2 Bt研究历史  11-12
  1.3 cry基因的克隆  12-13
  1.4 cry基因的定位  13-14
  1.6 Cry毒素晶体的装配  14-15
  1.7 Cry晶体毒素的结构  15-16
  1.8 Cry毒素的活性机制  16-18
  1.9 cry基因的应用  18-20
  1.10 本研究的目的及意义  20-21
第二章 材料与方法  21-32
  2.1 实验材料  21-22
    2.1.1 菌株与质粒  21
    2.1.2 培养基、抗生素和主要试剂  21-22
    2.1.3 实验仪器  22
  2.2 方法  22-32
    2.2.1 光学显微镜下观察  22-23
    2.2.2 扫描电镜观察  23
    2.2.3 Bt S2160-1菌株总DNA的提取  23
    2.2.4 Bt质粒DNA的提取  23-24
    2.2.5 PCR-RFLP鉴定  24-25
    2.2.6 cry30部分序列克隆  25
    2.2.7 感受态的制备与转化  25
    2.2.8 基因文库的构建及筛选  25-27
    2.2.9 SON-PCR克隆cry30Ga2  27-28
    2.2.10 核苷酸序列和氨基酸序列分析  28
    2.2.11 构建表达载体  28-29
    2.2.12 E.coli.BL21(DE3)中诱导表达和SDS-PAGE分析  29-32
第三章 结果与分析  32-50
  3.1 光学显微镜镜检  32
  3.2 扫描电镜观察  32-33
  3.3 提取总DNA的质量鉴定  33
  3.4 提取Bt质粒DNA的质量鉴定  33-34
  3.5 质粒DNA和总DNA进行PCR扩增  34-35
  3.6 PCR-RFLP鉴定  35-36
  3.7 Bt质粒DNA的酶切  36-37
  3.8 构建基因文库  37-39
  3.9 SON-PCR克隆基因全长序列  39-41
  3.10 氨基酸序列分析  41-44
  3.11 Cry30Ga2氨基酸序列疏水性分析  44-45
  3.12 构建Cry30Ga2相关蛋白氨基酸序列系统进化树  45-46
  3.13 Cry30Ga2蛋白的三级结构预测  46-47
  3.14 克隆Cry30Ga2基因全长序列  47-48
  3.15 Cry30Ga2基因在E.coli.BL21(DE3)中表达  48
  3.16 SDS-PAGE分析  48-50
第四章 讨论  50-53
  4.1 cry30Ga2基因全序列的获取  50-51
  4.2 cry30Ga2基因的克隆  51-52
  4.3 研究展望  52-53
参考文献  53-62
附录  62-63
致谢  63-65
读学位期间发表论文及研究成果情况  65

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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