学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

蜂毒肽基因的原核重组表达及其在Hela细胞中的靶向转录研究

作　者: 陈华伟
导　师: 钮利喜
学　校: 山西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蜂毒肽 融合表达 hTERT核心启动子 Hela细胞 肿瘤靶向性
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 2次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


为了将蜂毒肽(Melittin)与油体蛋白(Oleosin)在大肠杆菌中进行融合表达。分别构建油体蛋白基因同蜂毒肽基因或蜂毒肽前体蛋白基因的融合基因并将其插入到原核表达载体中,成功构建了pET-3a-ole-mel、pET-28a-ole-mel、pExSecI-ole-mel、pET-3a-ole-pmel、pExSecI-ole-pmel、pRSET-ole-pmel表达载体,并在油体蛋白基因序列和蜂毒肽基因序列之间设计有羟胺切割位点。分别转化至E. coli BL21(DE3)、E. coli BL21(DE3)plysS进行不同条件的IPTG诱导表达实验。重组载体pET-3a-ole-mel、pET-28a-ole-mel、pET-3a-ole-pmel转入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)、E. coli BL21(DE3)plysS诱导后均未能表达,pExSecI-ole-mel转入E. coli BL21(DE3)plysS诱导后出现明显死亡现象,pExSecI-ole-pmel、pRSET-ole-pmel转入E. coli BL21、E. coli BL21(DE3)plysS诱导后菌体生长缓慢,SDS-PAGE检测未见融合蛋白有明显表达条带。油体蛋白与蜂毒肽的融合蛋白未能在原核表达系统内大量表达,推测其可能以可溶形式存在且对宿主细胞具有致死作用。构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transeriptase, hTERT)基因核心启动子调控的EGFP基因表达载体。从体外培养的HepG2细胞中提取全基因组DNA,以此为模板,克隆得到hTERT基因启动子核心区基因片段(hTERTp)。设计引物以质粒pEGFP-N1为模板利用PCR扩增得到EGFP基因片段,将两者通过搭桥PCR扩增得到hTERTp-EGFP片段,经Sac I、Xba I双酶切定向插入到pGL3-Enhancer载体中,得到重组表达载体pGL3-hTERTp-EGFP。将该表达载体瞬时转染HELF细胞和HeLa细胞后观察EGFP蛋白表达情况。重组质粒经测序后确认插入序列正确无误,瞬时转染48小时后在HeLa细胞中可以看到EGFP蛋白的大量表达,而在HELF细胞中未见表达。成功构建了可以通过hTERT核心启动子调控治疗基因在肿瘤细胞中特异表达的重组表达载体pGL3-hTERTp-EGFP。在成功构建基因核心启动子调控的EGFP基因表达载体pGL3-hTERTp-EGFP的基础上,引入肿瘤治疗基因蜂毒肽基因,分别构建了肿瘤基因靶向治疗载体pGL3-hTERTp-EGFP-mel和pGL3-mel,经过酶切鉴定和测序,确定插入的基因片段是否准确。在相同条件下,分别将重组质粒pGL3-hTERTp-EGFP、pGL3-hTERTp-EGFP-wel和pGL3-mel瞬时转染Hela细胞,在激光共聚焦显微镜下观察EGFP蛋白表达情况及细胞形态,使用MTT法检测细胞凋亡情况。重组质粒经测序后确认插入的基因序列正确无误。瞬时转染48h后观察发现,转染重组质粒pGL3-hTERTp-EGFP的Hela细胞中EGFP大量表达,细胞形态正常,无凋亡迹象,而转染了重组质粒pGL3-hTERTp-EGFP-mel和pGL3-mel的Hela细胞出现凋亡现象,在凋亡的细胞中有大量的EGFP蛋白表达,在没有出现凋亡的细胞中EGFP蛋白表达量较弱。经过MTT法检测细胞凋亡也发现在48h的时间段也有比较明显的凋亡现象。研究也发现,无论蜂毒肽与EGFP蛋白融合表达,还是进一步将表达的蜂毒肽利用设计的共表达肠激酶切割下来,其对Hela细胞都具有促凋亡的作用,促凋亡的效果没有明显的区别。

全文目录


中文摘要  10-12Abstract  12-14第一章 综述  14-30  1. 蜂毒肽的来源  14-18    1.1.1 蜂毒肽的生物来源  14-15    1.1.2 蜂毒肽的基因工程技术研究  15-16    1.1.3 蜂毒肽融合蛋白的油体表达纯化系统  16-18  1.2. 蜂毒肽的结构与分子生物学机制  18-20    1.2.1 蜂毒肽结构与特性  18-19    1.2.2 蜂毒肽的分子生物学机制  19-20  1.3 蜂毒肽抗肿瘤的作用机制及研究进展  20-23    1.3.1 蜂毒肽抗肿瘤作用的机制  21    1.3.2 蜂毒肽的抗肿瘤研究及应用  21-23  1.4 蜂毒肽在临床方面的应用  23-24    1.4.1 抗风湿作用  23    1.4.2 镇痛及对神经系统的作用  23    1.4.3 抗HIV作用  23    1.4.4 对血液及心血管系统的影响  23-24    1.4.5 抗菌消炎和抗辐射作用  24  1.5 蜂毒肽作为农药的潜力  24-25    1.5.1 蜂毒肽作为农药抑菌杀菌的特性  24    1.5.2 蜂毒肽作为农药应用的优越性及可行性  24-25  1.6 本论文研究的目的和意义  25-26  参考文献  26-30第二章 蜂毒肽与油体蛋白在大肠杆菌中的融合表达研究  30-40  2.1 前言  30  2.2 材料与仪器  30-32    2.2.1 主要试剂  30-31    2.2.2 主要仪器  31    2.2.3 培养基  31    2.2.4 菌种和质粒  31-32    2.2.5 寡聚核苷酸  32  2.3 研究方法  32-35    2.3.1 蜂毒肽和油体蛋白基因的序列设计  32-33    2.3.2 蜂毒肽和油体蛋白基因的PCR扩增  33    2.3.3 表达载体的构建  33-34    2.3.4 表达载体转化大肠杆菌及诱导表达  34-35    2.3.5 SDS-PAGE  35  2.4 结果  35-38    2.4.1 蜂毒肽和油体蛋白融合基因的克隆  35    2.4.2 重组质粒酶切鉴定  35-36    2.4.3 工程菌的诱导表达  36-37    2.4.4 SDS-PAGE分析  37-38  2.5 讨论  38-39  参考文献  39-40第三章 肿瘤基因靶向治疗载体的构建和鉴定  40-48  3.1 前言  40  3.2 材料与试剂  40-41  3.3 研究方法  41-43    3.3.1 hTERT启动子核心区基因片段的PCR扩增和鉴定  41    3.3.2 EGFP基因的PCR扩增及其与hTERTp基因的搭桥PCR扩增  41-42    3.3.3 转染级质粒的制备  42    3.3.4 细胞培养及重组质粒的转染  42-43    3.3.5 转染细胞的EGFP蛋白表达情况观察  43  3.4 结果与分析  43-45    3.4.1 hTERT启动子核心区基因片段的克隆与鉴定  43    3.4.2 hTERTp-EGFP融合基因的构建  43-44    3.4.3 pGL3-hTERTp-EGFP重组质粒的构建及鉴定  44    3.4.4. EGFP蛋白在HELF和Hela细胞中的表达  44-45  3.5 讨论  45-47  参考文献  47-48第四章 蜂毒肽在Hela细胞中的靶向转录研究  48-60  4.1 前言  48  4.2 材料与仪器  48-50    4.2.1 主要试剂  48-49    4.2.2 主要仪器  49-50    4.2.3 寡聚核苷酸  50  4.3 实验方法  50-54    4.3.1 重组质粒pGL3-hTERTp-EGFP-mel的构建  50-51    4.3.2 重组质粒pGL3-mel的构建  51-53    4.3.3 转染级质粒的制备  53    4.3.4 细胞培养及重组质粒的转染  53    4.3.5 观察转染细胞的EGFP蛋白表达及凋亡情况  53-54    4.3.6 MTT法检测细胞凋亡  54  4.4 结果与分析  54-57    4.4.1 pGL3-hTERTp-EGFP-mel重组质粒的构建及鉴定  54    4.4.2 pGL3-mel重组质粒的构建及鉴定  54-55    4.4.3 转染细胞的EGFP蛋白表达及凋亡情况  55-56    4.4.4 MTT法检测细胞凋亡的情况  56-57  5 讨论  57-59  参考文献  59-60附录  60-61致谢  61-63

相似论文

  1. 猪白细胞介素2/6嵌合基因的融合表达及活性研究,S858.28
  2. 马链球菌兽疫亚种全菌结合类M蛋白亚单位灭活疫苗的研制,S858.28
  3. RNA干扰靶向沉默STAT1基因对宫颈癌细胞Hela生物学特性的影响,R737.33
  4. 柯萨奇病毒B3对Hela细胞mTOR/p70S6K表达的调控作用,R737.33
  5. EGCG诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其机制研究,R737.33
  6. 异常黑胆质成熟剂总酚与化疗药联合对Hela细胞的影响,R737.33
  7. 核桃外果皮抑制人宫颈癌HeLa细胞活性成分筛选,R284
  8. 口蹄疫病毒结构蛋白VP4基因的真核表达,S852.65
  9. 大鼠胰岛素原基因编码序列的克隆及表达,Q784
  10. 甘草素（liquirigenin）诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡及其分子机制的研究,R737.33
  11. 雷帕霉素在顺铂诱导Hela细胞凋亡中的协同作用,R737.33
  12. 1.人脑低级神经胶质瘤组织和癌旁组织的差异蛋白质组学研究 2.Hela细胞系导入TRIM45基因后的比较蛋白质组学研究,R739.41
  13. 紫草素等提取物对体外HeLa细胞增殖的影响,R285
  14. 脂麻花醇提物体外抗肿瘤生物活性及其机理的初步研究,R285.5
  15. 抗黄曲霉毒素B_1荧光重组抗体的制备,R392
  16. 大鼠TSHα cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达,Q78
  17. 纺织用化学品对体外细胞增殖抑制影响的研究,TS195.1
  18. 棉酚联合顺铂对宫颈癌Hela细胞增殖与凋亡的影响,R737.33
  19. 甲磺酸伊马替尼对乏氧Hela细胞放射敏感性影响的研究,R737.33
  20. RUNX3在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌Hela细胞增殖活性的影响,R737.33

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
© 2012 www.xueweilunwen.com