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可可西里土壤细菌多样性的研究

作　者: 苏进进
导　师: 余利岩；张玉琴
学　校: 北京协和医学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 纯培养 免培养 多相分类 变性梯度凝胶电泳 16S rRNA基因文库
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


可可西里被誉为“生命的禁区”,寒冷、少雨、辐射强、多大风是可可西里地区的气候特点。可可西里土壤微生物多样性很少得到研究,土壤微生物群落结构也不为所知。本研究采用纯培养和免培养相结合的方法对可可西里土壤微生物多样性进行探索,所研究的土壤样品均采自海拔4200-5300米之间。本研究采用22种分离培养基(M1-M22)及3种土壤预处理方法对土壤样品中的微生物进行选择性分离研究,其中M1-M11有利于分离放线菌,M12主要用于分离非放线菌细菌,培养基M13-M17为含盐培养基,培养基M18-M22适于碱性土壤样品IMB08-207—IMB08-218中耐碱和嗜碱微生物的分离。纯培养实验共分离放线菌48株,16SrRNA基因序列研究比表明它们分别属于链霉菌属(Streptomyces)、小月菌属(Microlunatus)、动孢菌属(Actinokineospora)、诺卡氏菌属(Nocardia)、小单孢菌属(Micromonospora)、红球菌属(Rhodococcus)、糖霉菌属(Glycomyces)、原小单胞菌属(Promicromonospora)、微杆菌属(Microbacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、韩国生工属(Kribbella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、威廉姆斯菌属(Williamsia),同时还得到非放线菌细菌30株,分别属于贪食菌属(Variovorax)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)。16S rRNA基因序列分析显示,纯培养实验中分得到的菌株CPCC100076T与小月菌属菌株的16S rRNA基因相似性最高(95.8-98,0%),其中,与菌株Microlunatus parietis DSM22083T的相似性达98.0%。在基于16S rRNA基因分析的系统进化树上,菌株CPCC100076T聚类于小月菌属内与菌株Microlunatus parietis DSM 22083T聚成一个稳定的亚分支。多相分类研究数据不支持将菌株CPCC100076T归入Microlunatus parietis种内。因此,我们提议菌株CPCC100076T代表了小月菌属的一个新物种。从纯培养分离结果可以看出,在所有的土壤样品中,IMB08-049中的微生物多样性最好,共分离得到细菌19株,其中放线菌7株,非放线菌细菌12株。这些菌株分别属于叶杆菌属(Phyllobacterium)、贪食菌属(Variovorax)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、小月菌属(Microlunatus)、原小单胞菌属(Promicromonospora)、韩国生工属(Kribbella)和芽孢杆菌属(Bacillus),而土壤样品IMB08-056中未分离得到任何菌株。本研究分别采用16S rRNA基因文库和变性梯度凝胶电泳(DGGE)相结合的方法对纯培养实验中多样性最好的土壤样品IMB08-049和未得到任何分离株的IMB08-056进行了分子生态学的研究。DGGE电泳结果发现,土壤样品IMB08-049基因组16S rRNA基因的V3区片段经变性梯度凝胶电泳(DGGE)后获得了17个条带,而土壤样品IMB08-056获得了条带约为15条,可以粗略估计土样IMB08-049中1%以上的细菌种群为17种,土样IMB08-056中1%以上的细菌种群为15种。软件Quantity one分析表明,土壤样品IMB08-049和IMB08-056中的微生物多样性较低,这可能和其所处的极端环境有一定关系。而土壤样品IMB08-049较IMB08-056细菌种类相对丰富。本研究分别构建了基于通用引物PCR扩增的细菌16S rRNA基因克隆文库,通过AfaⅠ和HaeⅢ限制性内切酶对两份土壤样品细菌16SrRNA基因文库中的克隆进行ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Rstriction Analysis)分析,将所有阳性克隆分为若干个可操作分类单元(OTU)。分析结果表明,IMB08-049号土壤样品中的细菌可分为19个OTUs,选择各OTU中代表性克隆子进行测序与系统发育分析,结果表明该土壤样品中细菌在系统进化树中分属于3个类群：其中变形菌门(Proteobacteria)为绝对的优势种群,其次是放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。19个OTUs中有14个OTUs的16S rRNA基因序列与GeneBank数据库中已培养细菌的序列相似性高于97%,另外的5个与已培养或未培养的属种的16S rRNA基因相似性低于或等于97%。而土壤样品IMB08-056中的细菌可分为23个OTUs。16S rDNA序列及系统发育树分析结果表明,该土壤样品中细菌分属于3个类群：其中变形菌门(Proteobacteria)为优势种群,其次为放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。23个OTUs中有16个OTUs的16S rRNA基因序列与GeneBank数据库中已培养细菌的序列相似性高于97%,另外的7个与已培养或未培养的属种的16S rRNA基因相似性低于97%。对土壤样品IMB08-049的DGGE和16S rRNA基因文库研究结果表明,相对于普通环境样品,该样品中微生物多样性较低。DGGE电泳中三条优势条带的测序结果与16S rRNA基因文库中优势种群的分析结果具有很好的一致性。但对应的这三个OTUs在本研究的纯培养实验中均未获得分离培养。结合纯培养和免培养两种方法,我们初步认识了可可西里极端环境样品中微生物的多样性。研究结果表明,可可西里土壤中含有很多未培养的微生物,值得进一步研究。我们需要在根据特定微生物设计特定培养基及培养条件进行选择性分离上作更多的探索研究。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-13
缩略语表  13-14
第一部分 纯培养方法对可可西里土壤细菌多样性的研究  14-23
  一、材料与方法  14-20
    1. 土壤样品  14-16
    2. 培养基  16-19
    3. 土壤预处理方法  19
    4. 菌种分离、纯化和保藏  19-20
  二、结果与讨论  20-23
    1. 不同土壤样品中细菌的分离情况  20-21
    2. 可可西里土壤样品IMB08-049中分离株的16S rRNA基因序列分析结果  21-23
第二部分 菌株CPCC100076~T的多相分类研究  23-40
  一、材料与方法  23-34
    1. 形态和培养特征  23
    2. 生理生化特征  23-26
    3. 细胞化学研究  26-29
    4. 16S rRNA基因扩增  29-30
    5. 系统发育分析  30
    6. DNA G+C mol%含量测定  30-34
  二、结果与讨论  34-40
    1. 形态观察结果  34-35
    2. 生理生化实验结果  35-37
    3. 测试菌株的化学组分分析结果  37
    4. 菌株的16S rRNA基因分析  37-38
    5. 菌株的分类研究结果  38-40
第三部分 免培养方法对可可西里土样IMB08-049、IMB08-056中细菌多样性的研究  40-67
  (一) 应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法对IMB08-049、IMB08-056土壤样品细菌多样性的研究  40-51
    一、材料与方法  40-46
      1. 样品  40
      2. 主要仪器和设备  40
      3. PCR引物  40-41
      4. 土壤基因组DNA的提取  41-42
      5. 16S rRNA基因V3区基因扩增  42
      6. PCR产物纯化  42-43
      7. 试剂准备  43-44
      8. DGGE电泳  44-45
      9. 染色  45
      10. DGGE图谱遗传多样性分析  45
      11. DGGE条带的回收和转化重新扩增  45
      12. DGGE回收条带的克隆和转化  45
      13. DGGE条带的序列测定和同源性比较  45-46
    二、结果及讨论  46-51
      1. 可可西里土壤总DNA提取  46-47
      2. 16S rDNA V3区片段的PCR扩增  47
      3. DGGE分析  47-50
      4. DGGE优势条带的测序及序列比对分析  50-51
  (二) 应用16S rRNA基因文库方法对IMB08-049、IMB08-056号土壤细菌多样性的研究材料和方法  51-67
    一、材料与方法  51-57
      1. 样品  51
      2. 主要仪器和设备  51
      3. 主要试剂及来源  51-52
      4. 菌株与载体  52
      5. PCR引物  52
      6. 分析软件  52
      7. 培养基  52
      8. 土壤样品总DNA提取  52-53
      9. PCR反应  53
      10. PCR产物纯化  53-54
      11. PCR产物末端加A反应  54
      12. 加尾的PCR产物与pGEM-T Easy载体的连接  54
      13. DH5α感受态细胞的制备  54-55
      14. 转化和蓝白斑筛选  55
      15. 16S rRNA基因扩增片段的限制性酶切分析(amplified ribosomal DNArestriction analysis)  55-56
      16. DNA序列测定  56
      17. 16S rRNA基因的系统发育分析  56
      18. 统计分析  56
      19. 核苷酸序列登录号  56-57
    二、结果与讨论  57-67
      1. 土壤样品中细菌16S rRNA基因的扩增  57
      2. 16S rRNA基因的阳性克隆验证  57-58
      3. 16S rRNA基因扩增片段的限制性酶切片段分析  58-60
      4. 系统发育分析  60-65
      5. 文库评价  65
      6. 纯培养和免培养结果对比  65-67
结论  67-69
参考文献  69-72
文献综述——分子生物学方法在微生物生态学中的应用  72-81
  参考文献  78-81
致谢  81

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