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扩展青霉脂肪酶热稳定性的分子突变

作　者: 刘燕雅
导　师: 林琳
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 扩展青霉脂肪酶 定点突变 随机突变 易错PCR
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本研究利用定点突变和随机突变的方法,对扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase, PEL)进行了蛋白质工程改造。1.PEL的定点突变采用重叠延伸PCR的方法,对扩展青霉脂肪酶进行多个点突变,选取了十一个突变位点,构建了7个单点突变体和8个叠加突变体(与随机突变体ep8叠加)。将获得的突变基因在毕赤酵母中表达,并进行酶学性质的研究。(1)P197E的单点突变及叠加突变：PEL-P197E酶活为556U/mL,Tm值比野生型提高了0.90C。PEL-ep8-P197E酶活为592U/mL,其Tm值比野生型脂肪酶PEL的提高2.80C,比随机突变体PEL-ep8提高2.2℃；此外,叠加突变体PEL-ep8-P197E的底物特异性发生了改变。(2)K152R的单点突变及叠加突变：PEL-K152R酶活为530U/mL,PEL-ep8-K152R酶活为416U/mL,二者的热稳定性与与野生型无明显差别。(3)P102L的单点突变及叠加突变：PEL-P102L酶活为300U/mL。PEL-ep8-P102L的酶活为612U/mL,最适作用温度提高了50C,Tm比野生型提高了3.60C,比随机突变体提高了2.6℃。(4)N166D的单点突变及叠加突变：PEL-N166D、PEL-ep8-N166D的酶活分别为236 U/mL、252U/mL, PEL-ep8-N166D的Tm比野生型PEL下降1.1℃,比随机突变体下降2.1℃。(5)P163A的叠加突变：PEL-ep8-P163A的酶活比野生型降低6.3%,比随机突变体降低33.8%；其Tm比野生型PEL提高了1.0℃,与随机突变体一致。(6) K120R、M193V的叠加突变：PEL-ep8-K120R的最适作用降低了5℃；酶活降低较明显；热稳定性比野生型降低1.5℃,比随机突变体PEL-ep8降低2.5℃。PEL-ep8-M193V的酶活很低,仅有40 U/mL。(7) G205A、K94D、K94R、W169N的单点突变：PEL-G205A、PEL-K94D、PEL-K94R、PEL-W169N在YPOM板上均没产生明显的透明圈。2.PEL的随机突变通过易错PCR的方法对扩展青霉脂肪酶进行随机突变,经过平板透明圈法的初筛和摇瓶复筛获得两株热稳定性有所提高的突变体HR2、HR3。HR2的酶活为498U/mL,Tm值为39.3℃,比野生型脂肪酶PEL的提高了0.6℃。测序结果表明：HR2突变体脂肪酶基因第246位的A突变为G,即脂肪酶的第82位的Lys(AAG)突变为Arg(AGG),同时还产生了一个同义突变,第790位的T突变为C,即编码Ala的基因由GCT突变为GC℃。HR3的酶活为552U/mL,Tm值为42.1℃,比野生型脂肪酶PEL的提高了3.4℃。测序结果表明：HR3突变体脂肪酶基因第204位的T突变为C,即脂肪酶的第68位的Leu(CTC)突变为Pro(CCC)；第426位的A突变为G,即脂肪酶的第142位的Lys(AAG)突变为Arg(AGG)。综上,本研究通过定点突变共构建了15个脂肪酶突变体,获得了两株较好的突变体：①PEL-ep8-P197E的热稳定性在随机突变体PEL-ep8的基础上,进一步提高了2.2℃,比野生型PEL提高了2.8℃,酶活为592U/mL。②PEL-ep8-P102L的热稳定性在随机突变体PEL-ep8的基础上,进一步提高了2.6℃,比野生型PEL提高了3.6℃,最适作用温度降低5℃,酶活为612U/mL。此外,本研究还通过随机突变获得一株较好的突变体,HR3热稳定性比野生型提高了3.4℃,酶活为552U/mL

全文目录


摘要  2-4
Abstract  4-7
中文文摘  7-13
第一章 绪论  13-35
  1 理性设计  14-15
  2 非理性设计  15-34
    2.2 突变体库的构建策略  16-29
      2.2.1 基于PCR而实现的随机突变  16-19
      2.2.2 基于同源重组而实现的随机突变  19-27
      2.2.3 基于非同源重组而实现的随机突变  27-29
    2.3 定向进化筛选策略  29-34
      2.3.1 表型观察选择和筛选  29-30
      2.3.2 微孔板滴定法  30-31
      2.3.3 各种展示技术  31-34
  3 半理性设计  34-35
第二章 材料与方法  35-51
  1 实验材料  35-38
    1.1 菌种和质粒  35
    1.2 酶与试剂  35
    1.3 常用培养基及缓冲液  35-37
    1.4 寡核苷酸引物  37-38
    1.5 常用仪器  38
  2 实验方法  38-51
    2.1 扩展青霉脂肪酶的定点突变  38-47
      2.1.1 P197E、K152R、P102L、N166D的单点突变及叠加突变  38-44
      2.1.2 P163A、M193V、K120R的叠加突变  44-46
      2.1.3 G205A、K94R、W169N、K94D的单点突变  46-47
    2.2 扩展青霉脂肪酶的随机突变  47-51
      2.2.1 突变体库的获得  47-48
      2.2.2 随机突变基因表达载体的构建及表达  48
      2.2.3 酶学性质的测定  48-49
      2.2.4 突变体脂肪酶基因的序列测定  49-51
第三章 结果与分析  51-83
  1. PEL的定点突变  51-78
    1.1 突变点的选择  51-52
    1.2 P197E的单点突变及叠加突变  52-58
    1.3 K152R的单点突变及叠加突变  58-64
    1.4 P102L的单点突变及叠加突变  64-67
    1.5 N166D的单点突变及叠加突变  67-71
    1.6 P163A的叠加突变  71-73
    1.7 K120R、M193V的叠加突变  73-76
    1.8 G205A、K94R、K94D、W169N的单点突变  76-78
  2 PEL的随机突变  78-83
    2.1 随机突变基因的获得  78-79
    2.2 表达质粒库的构建及在毕赤酵母中的表达  79-80
    2.3 突变体的酶学性质  80-82
    2.4 突变体核苷酸序列测定  82-83
第四章 小结与讨论  83-89
  1 PEL的定点突变  83-86
  2 PEL的随机突变  86-89
结论  89-93
  1 定点突变  89-90
  2 随机突变  90-93
参考文献  93-107
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  107-109
致谢  109-111
个人简历  111-113

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶
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