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一氧化氮与宫颈不同亚型人乳头瘤病毒感染之间的关系及其对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响

作　者: 魏雪敏
导　师: 隋龙
学　校: 复旦大学
专　业: 妇产科学
关键词: 宫颈癌一氧化氮细胞凋亡细胞增殖 HPV感染
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

HPV (Human papillomavirus)感染是最常见的性传播感染(Sexually Transmitted Infections, STI)。目前美国约2000万人感染HPV,每年增加约620万人。据推测,约80%以上性活跃女性截至到50岁时可有感染HPV的机会。我国北京地区流行病学研究显示,在5552名25—54岁性活跃妇女中,HPV总体感染率为6.7%而无宫颈病变的女性感染率为4.8%,最常见亚型为16,58,33对于大部分感染HPV的女性,由于机体的免疫系统可以将其清除,所以感染不会持续或发展至出现严重的临床症状。据CDC报道,约70%的新发HPV感染会在1年内清除,约90%在2年内清除。中位感染持续时间为8个月。仅有约10%感染会持续,因为持续高危型HPV感染是发生宫颈癌或癌前病变的必要条件,所以这部分感染者成为宫颈癌的高危人群。目前对于影响HPV清除和持续感染的因素及宫颈局部微环境在此过程中所起的作用尚未清楚。研究发现,慢性感染与多种肿瘤的发生发展密切相关,可以促进炎性细胞(如肿瘤相关巨噬细胞)及炎性介质(如细胞因子、趋化因子、前列腺素以及一氧化氮等)占主导、调控增生的信号网络紊乱的肿瘤微环境形成,从而参与肿瘤恶变过程。近年来,肿瘤微环境的研究引起人们高度重视,成为肿瘤研究的热点。研究发现一氧化氮(nitric oxide, NO)是慢性感染致肿瘤形成的微环境中的关键组分。高危型HPV持续感染是宫颈上皮内瘤变(CIN)以及宫颈癌发生发展的必要条件,而人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染、吸烟、多产、炎症等因素可诱导宫颈局部产生NO,参与癌变过程。因此,明确HPV感染的宫颈局部微环境中NO所起的作用及机制具有重要意义。本研究分为两部分：(1)运用Griss法检测宫颈管内NO的释放量,探讨不同HPV感染状态宫颈局部微环境中NO表达的变化；(2)体外模拟不同浓度NO,对HeLa细胞及Caski细胞生长,HPVE6、E7mRNA及抑癌蛋白P53表达的影响,探讨NO对不同亚型HPV细胞生长、凋亡的影响及影响HPV致癌变的机制。第一部分宫颈局部微环境中NOx释放量与不同亚型HPV感染之间的关系目的：了解不同级别CIN宫颈局部微环境中NOx (nitric oxide,一氧化氮)的释放量与不同型别HPV感染之间的关系方法：选择2009年12月1日至2010年8月5日在复旦大学附属妇产科医院宫颈疾病诊疗中心阴道镜室检查的患者115例,年龄21至77岁,中位年龄35岁。在知情前提下,取得病人同意并在知情同意书上签字,收集病人相关病史资料。入组病人条件：术前应排除阴道炎症,清洁度Ⅰ-Ⅱ度；时间距下次月经来潮不少于7天,以月经干净后3—7天为佳；取材前未行妇科检查,24小时内无性生活,无其他局部治疗；取宫颈管粘液检测NOx时,排除有宫颈局部出血的标本。患者取膀胱截石位,以阴道窥器暴露子宫颈,擦净宫颈粘液及分泌物。用干棉球置入宫颈管内约1cm,静置20秒后,将干棉球取出放入含生理盐水1.5ml的玻璃管内涮洗2min后,然后Griss法间接检测NOx量。同时,用HPV取材设备取样,送往检验,用21分型导流杂交方法检测HPV亚型,实验步骤均按试剂盒说明书进行。结果：宫颈局部NOx的释放量与HPV感染亚型有关,高危型HPV组(47.6±1.4)μmol/L与阴性对照组(22.8±0.3)μmol/L及低危型HPV组(24.1±1.2)μmol/L相比NOx的释放量显著升高,具有明显统计学差异(P<0.005)而低危型HPV组(24.1±1.2)μmol/L与阴性对照组(22.8±0.3)μmol/L之间NOx的释放量无明显统计学差异(P>0.05)。结论：高危型HPV感染的宫颈局部黏液中NO释放量明显高于低危型HPV感染组和HPV阴性对照组,宫颈局部微环境中NO释放量与高危型HPV感染具有相关性。第二部分外源性一氧化氮供体(SNP)对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响目的：探讨外源性一氧化氮供体硝普钠(SNP)对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响方法：体外培养宫颈癌细胞Caski、Hela,加入不同浓度的一氧化氮供体(SNP),采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长情况；采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况；应用SYBR GreenⅠ荧光实时定量(Real-time) PCR法及蛋白质印迹法检测SNP作用后对HPVE6、E7mRNA的表达及P53蛋白表达的影响。结果：SNP作用于Caski、Hela细胞24h后,能抑制细胞增殖,促进其凋亡,且1mmol/L为最佳作用浓度；HPV18 E6/E7mRNA加药后表达显著下降(P<0.05),P53蛋白表达上升(P<0.05),但HPV16 E6/E7mRNA和P53蛋白加药前后变化不明显(P>0.05)。结论：SNP能抑制宫颈癌细胞的增殖,促进其凋亡,降低HPV18 E6/E7mRNA的表达及活化P53蛋白,其机制可能是宫颈腺癌细胞Hela对SNP更敏感。NO释放增加可能是宫颈局部微环境调控清除HPV的粘膜免疫机制之一。

一氧化氮与宫颈不同亚型人乳头瘤病毒感染之间的关系及其对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响

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