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骨髓间充质干细胞血肿周边移植对大鼠脑出血的治疗作用及相关机制的探究

作 者: 王梓晗
导 师: 王苏平
学 校: 大连医科大学
专 业: 神经病学
关键词: 脑出血 间质干细胞 移植 细胞凋亡 细胞再生
分类号: R743.34
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


目的:大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞,可以从适龄大鼠的骨髓中分离取得。最近研究表明BMSCs移植到中枢神经系统中可以成功存活,并在该环境中可以分化为神经细胞及相关支持细胞,可以对神经损伤性疾病有治疗作用。BMSCs可以提取且体外扩增后中枢神经系统内移植,从而治疗脑出血、外伤、缺血、甚至帕金森综合症等神经系统损伤性及变性性疾病。本实验的目的就是研究大鼠骨髓间充质干细胞提取后体外扩增,利用细胞表型鉴定其具有干细胞特性后,移植于大鼠脑内血肿周围,观察大鼠神经功能改善情况,观察干细胞移植后在大鼠中枢神经系统中的存活、分化、及对内源性细胞凋亡、神经因子分泌、神经元增殖分化的情况。方法:1.大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的提取、鉴定、及体外标记。无菌条件下提取4-6周大鼠的骨髓,用密度梯度离心法分离提取有核细胞,利用BMSCs贴壁的特性去除其余的有核细胞,用含10%低糖胎牛血清的培养基培养,传代扩增,得到较纯的BMSCs,用流室细胞仪检测细胞表面CD90、CD29、CD45、CD11bc的表达,对BMSCs的纯度及性质进行鉴定后,用Brdu(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)进行体外标记6代以内的BMSCs,确定标记成功后用于移植。2.脑出血大鼠的造模及BMSCs的血肿周围移植。选择成年雄性SD大鼠192只,体重在200-250克左右,用10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉(4ml/kg)确定麻醉成功后将SD大鼠俯卧位固定于鼠立体定位仪上,暴露颅骨后以前囟为原点,向右3.5mm,向后0.5mm,用骨钻钻开颅骨并保留硬脑膜,直径约1.0mm,将抽好Ⅳ型胶原酶的微量注射器固定于鼠定位仪上,沿钻好的颅孔缓慢的进针约5.5mm(尾状核部分),缓慢注入Ⅳ型胶原酶(0.2ul、每1.0ul含Ⅳ型胶原酶0.2U),解剖及神经功能判断造模成后,在定位仪的指导下血肿周围移植BMSCs。3.实验动物分组。将造模成功的大鼠随机分为两组,每96只大鼠一组,共计192只。组1对照组:脑出血造模成功后48h用微量注射器在定位仪的辅助下,血肿周围注射生理盐水10ul。组2实验组:脑出血48h后用微量注射器在定位仪的辅助下,注射生理盐水细胞溶液10ul(含BMSCs 1×10~6个)。4.神经功能评分,运动功能评分:所有动物在28天内全部存活。移植后第1d、3d、7d、14d、21d、28d分别进行神经学缺陷程度评分,观察实验组较对照组神经功能是否有明显改善,神经功能评估差异是否有统计学意义。免疫组织化学检测细胞存活增殖(Brdu)及血肿周围NF-200(神经丝蛋白)、Caspase-3(细胞内源性凋亡酶)表达情况。Brdu、NF-200、Caspases-3免疫组织化学染色,观察Brdu表达阳性染色细胞的存活及数量增减,观察血肿周围NF-200、Caspases-3染色情况从而观察神经微丝增生及细胞凋亡情况。免疫印迹法(Western blot)检测Bcl-2(B cell lymphoma/leukemia-2)及ART(Artemin胶质细胞系源性神经营养因子)的情况。酶联免疫吸附ELISA法检测G-CSF(粒细胞集落刺激因子)及BDNF(神经营养因子)的情况。观测BMSCs的分泌功能对凋亡及神经元增生的影响。结果:骨髓基质细胞在脑出血大鼠血肿周边移植,可以迁移到血肿周围地区并分化成神经元和星形胶质细胞、神经胶质细胞。移植组与单纯出血组比较神经功能(mNSS)在移植后第7,14,21,28天得到明显得到改善,(P<0.05)有统计学意义,但在1和3天的差异并不显著。实验还显示,在移植后24小时和72小时脑出血后出血量显著减少。对脑出血后血肿灶周围区域Brdu标记细胞、caspase 3阳性细胞,丝蛋白(NF-200)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达情况进行观察统计,发现BMSCs移植组阳性细胞数明显高于单纯出血组。移植组脑组织中Akt、Bcl - 2蛋白质含量及G - CSF和BDNF都显著高于单纯出血组。结论:血肿周边移植骨髓间充质干细胞可以显著改善神经功能的恢复,减少脑出血量。这些作用的机制可能与骨髓间充质干细胞存活和分化成神经细胞及其支持细胞,促进血肿吸收,增加抗凋亡蛋白和营养因子有关。

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摘要  6-8Abstract  8-11前言  11-13材料和方法  13-20结果  20-26讨论  26-29结论  29-30参考文献  30-34综述  34-42  参考文献  39-42附录  42-43  英文缩略词  42-43致谢  43

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病 > 急性脑血管疾病(中风) > 脑出血
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