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癫痫是由各种原因引起的脑细胞群异常放电所致的发作性、暂时性的脑功能障碍综合征。我国估计已有600万左右的癫痫患者,每年新增癫痫病人40余万,至少有约120万癫痫患者癫痫发作药物难以控制,给社会和家庭造成了很大的经济负担和心理压力。大多数癫痫患者经合理用药可控制发作,但仍有约20%～30%的药物难治性癫痫患者需外科手术治疗,目的是通过毁损异常放电的传导通路或切除致痫灶,使癫痫发作减少或停止发作。据报道,约有72%-90%的患者手术后癫痫发作可得到缓解。然而传统的癫痫外科手术要切除一定范围的正常脑组织,破坏性大,且多用于非功能区癫痫。运动功能区癫痫的手术治疗,既要有效的控制癫痫,又要最大程度地保留运动功能区皮层的正常功能,否则癫痫灶切除后常会造成严重的神经功能障碍。目前,致痫灶切除术、多处软脑膜下横切术及皮层热凝术为运动功能区癫痫手术治疗的常用方法,但这三种方法均为开颅手术,存在创伤较大、治疗范围受开颅骨窗限制、并发症发生率相对较高等不足。随着微创神经外科的发展,伽玛刀在治疗颅内肿瘤,脑内动静脉畸形、功能性疾病等方面显示了微创的优点,已成为不开颅治疗颅内病变的重要手段,能否借助微创的伽玛刀对癫痫进行治疗,已引起国内外学者广泛关注。目前,应用伽玛刀治疗难治性癫痫的报道日渐增多,并取得了较好的效果,但脑重要功能区癫痫的伽玛刀治疗鲜见相关报道。我科总结近年来伽玛刀治疗的11例中央区癫痫,在取得较高总有效率(91%)的同时,也发现了2例患者出现并发症(较顽固的放射性水肿)。若要提高伽马刀治疗有效率,第一在于精确而完善的术前评估;第二在于放射剂量的把握。基于此种考虑,设计了后几部分的基础实验,拟通过制作运动区癫痫动物模型,应用伽玛刀低剂量及高剂量组对比照射对运动区癫痫进行治疗,并检测相关生物学指标,旨在探索伽玛刀治疗运动区癫痫的机制及最佳治疗剂量。目前认为,伽马刀治疗运动区癫痫与多种因素有关,如细胞凋亡、兴奋性氨基酸及抑制性氨基酸的失衡、氧自由基、离子通道等有关,本实验通过研究猫运动区癫痫模型建立后,对比伽马刀照射前后光电镜表现、凋亡指标、SOD、MDA、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、NMDA受体亚基R1、R2A、R2B等变化,以探讨运动区癫痫的生物学机制及伽玛刀照射的干预作用。第一部分伽玛刀治疗中央区癫痫疗效分析目的:分析伽玛刀治疗中央区癫痫疗效。方法:选河北省人民医院功能神经外科自2002年10月至2008年12月行术前评估(临床症状特征、视频脑电图VEEG、MRI、脑磁图MEG、SPECT/PET,考虑运动功能区癫痫者,加做运动功能区定位)至少有四项符合,确诊为隐源性中央区癫痫患者癫痫的患者共11例,确定癫痫灶部位,行伽玛刀治疗,并行术前术后心理状态及智力评估。周边剂量12-14GY/50%。结果:按国际癫痫学会外科手术疗效分类法:Ⅰ级5例,Ⅱ级5例,Ⅲ级1例。Ⅰ～Ⅱ级为治愈及有效,总有效率91%;12Gy组Ⅰ级率最高,为75%,14Gy并发症发生率最高,为66.7%。患者伽玛刀治疗前显示与正常人常模比较存在不良心理状态(P<0.01),经伽玛刀治疗后3个月,心理状态得到不同程度的缓解,在人际关系、抑郁、焦虑、敌对以及恐怖等方面得到明显改善(P<0.05),智力也得到明显改善(P<0.05)。全部患者复查头部CT或MRI,未见异常反应出现。抗癫痫药血药浓度控制在正常范围以内。结论:伽玛刀治疗可较满意控制运动功能区癫痫发作,安全、损伤小;可以改善癫痫患者心理状态及智力水平;治疗的关键在于术前评估及及放射剂量把握,低剂量伽玛刀治疗效果较好,12Gy剂量治疗效果更好。第二部分猫运动区癫痫模型伽玛刀照射前后脑电图及光电镜变化目的:成功建立猫运动区癫痫模型,对比不同剂量的伽玛刀照射前后不同时间点猫额叶运动区致痫灶的形态学及脑电图变化。方法:选用健康家猫36只,雄性,体重2500~3500 g。分为正常对照组(6只)、癫痫模型非照射组(6只)、伽玛刀12Gy照射组(12只)和伽玛刀24 Gy照射组(12只);各组动物用3%戊巴比妥钠麻醉后开颅在左侧大脑额叶运动区注入8%氢氧化铝乳剂100ul或生理盐水100ul。术后每天用视频监测系统记录猫的行为学变化,即生活习惯、进食、有无抽搐发作及发作持续时间;致痫成功后第8周行伽马刀照射,观察时间点为致痫后2周、4周、8周、16周(即伽玛刀照射后8周)及32周(即伽玛刀照射后16周)共五个时间点。每一组每一个时间点选取1或2只健康家猫,正常对照组及癫痫模型非照射组动物不进行伽玛刀照射,另两组动物分别给予不同剂量伽玛刀照射,于上述不同时间点用MS4000U电生理监测仪描记实验动物致痫区皮层脑电图观察并记录脑电图的变化,处死后,取标本通过光学显微镜及透射电子显微镜观察组织形态学改变。结果:形为学结果:各组实验动物于术后一天内进食较少,精神萎靡,两至三天后恢复正常进食,精神好转,致痫模型组及伽马刀照射组30只猫先后于皮层注射氢氧化铝悬浊液后6-8周出现右后下肢的抖动、阵挛及强直,有的随后出现四肢抽动及全身阵挛,达到Racine分级的Ⅴ级。对照组6只猫皮层注射等量生理盐水后均未出现明显异常行为改变。伽马刀照射组照射后未再次出现癫痫发作。致痫模型组及伽马刀照射组30只猫4周时开始出现棘波和棘慢波放电,波幅较低,为偶发放电,经统计处理结果为3.5±1.8次/分;于8周时异常放电次数达到最高,波幅最高,呈丛集性棘波或棘慢波异常放电,经统计处理结果为55.1±6.2次/分;16周放电次数较8周减少,但仍有较多棘波放电,放电次数为15.5±1.6次/分;32周放电次数为12.8±2.5次/分,放电较16周无明显差异。伽马刀照射组在16周(即伽马刀照射后8周)只有少量低幅放电,经统计处理结果为4.7±2.5次/分;在32周(即伽马刀照射后16周)只有零星低幅放电,经统计处理结果为1.6±0.9次/分。而高低剂量伽马刀照射组间没有明显差异。正常对照组一直未见异常棘波放电,经统计学处理,在同一时间点,致痫模型组与正常对照组棘波放电次数有明显差别,伽马刀照射组与致痫模型组间有明显差别。HE染色病理结果:光镜:光镜下正常对照猫的脑组织未见明显异常。致痫模型组造模后4周、8周癫痫猫皮质可见红色神经元、噬神经现象及卫星现象,同时可见致痫区氢氧化铝晶体及周围胶质细胞明显增生(主要为星形胶质细胞及小胶质细胞);8周后还可见不同程度的神经元胞体变性坏死,同时低倍镜下可见皮层变薄、灰质细胞减少及白质传导纤维替代。伽马刀照射组8周前表现同前,8周后表现为细胞变性坏死程度较致痫模型组为轻,大多细胞呈凋亡状态,核质疏松,核固缩,但高剂量照射组坏死程度较低剂量为重,且细胞水肿现象较重。超微病理结果:正常对照组猫的脑组织未见明显异常。致痫模型组造模后4周、8周癫痫猫皮质主要表现为变性。8周后细胞普遍呈坏死状态:主要细胞器溶解;胶质细胞肥大、增生;神经纤维细胞体和树突上的对称型突触小泡减少。伽马刀照射组8周前表现同前,8周后表现为细胞变性坏死程度较致痫模型组为轻,大多细胞呈凋亡状态,但高剂量照射组坏死程度较低剂量为重。结论:氢氧化铝致猫运动区癫痫模型制作成功。伽马刀照射可有效抑制痫性放电,伽马刀治疗癫痫有效。氢氧化铝致猫运动区癫痫模型病理基础为神经元缺失;金属沉积灶周围胶质细胞肥大、增生;神经环路重建;细胞体和树突上的对称型突触小泡减少。24Gy组细胞损伤程度较12Gy组为重,12Gy伽马刀照射剂量为最佳。第三部分猫运动区癫痫模型伽玛刀照射前后凋亡指标及SOD、MDA变化目的:对比不同剂量的伽玛刀照射前后不同时间点猫额叶运动区致痫灶的细胞凋亡、bcl-2蛋白的表达情况及SOD、MDA的变化,探讨细胞凋亡、bcl-2蛋白的表达情况及SOD、MDA与伽玛刀照射治疗运动功能区癫痫机制的关系。方法:在各个观察时间点,即致痫后2周、4周、8周、16周(即伽玛刀照射后8周)及32周(即伽玛刀照射后16周)六个时间点,每一只猫进行完第一部分的处理后,取标本制成石蜡切片,然后,用免疫组化的方法检测bcl-2蛋白,用原位末端标记法(TUNEL法)检测脑细胞凋亡,同时取致痫区脑组织通过分光光度计测量SOD、MDA的变化情况。所有的数据均采用均数±标准差(x±s),用SAS统计软件进行分析比较,以P<0.05为差异有显著性。结果:致痫模型组SOD含量为153.45±21.52U/mgprot,低剂量伽马刀照射组SOD含量为172.45±17.62U/mgprot,高剂量伽马刀照射组SOD含量为170.62±15.37U/mgprot,正常对照组SOD含量为182.01±27.49U/mgprot;氢氧化铝模型组MDA含量为0.5791±0.1366umol/gprot,低剂量伽马刀照射组MDA含量为0.3106±0.0546umol/gprot,高剂量伽马刀照射组MDA含量为0.3076±0.0342umol/gprot,正常对照组MDA含量为0.2596±0.0628 umol/gprot。细胞凋亡改变:(1)在每一个时间点,高剂量伽马刀照射组凋亡细胞的阳性表达率>低剂量伽马刀照射组>致痫模型组及对照组,经统计学分析,高剂量伽马刀照射组与低剂量伽马刀照射组、伽马刀照射组与非照射组差异有显著性(P<0.01)。(2)每一个伽玛刀照射组在照射后不同时间点凋亡细胞的动态表达差异不大。细胞bcl-2蛋白表达水平改变:(1)在每一个时间点,高剂量伽马刀照射组bcl-2的阳性表达率<低剂量伽马刀照射组<致痫模型组及对照组,经统计学分析,伽马刀照射组与非照射组差异有显著性(P<0.01)。(2)每一个伽玛刀照射组在照射后不同时间点bcl-2的阳性表达率差异不大。结论:致痫模型组致痫区脑组织氧化和抗氧化系统平衡失调,产生过量的氧自由基,进一部损伤脑组织,而清除氧自由基的SOD由于过量消耗而减少,加重了细胞变性、坏死,导致神经元的缺失及神经元异常放电,促进癫痫发作。而伽马刀照射重新建立脑组织氧化和抗氧化系统平衡,减少氧自由基生成,保护神经细胞,抑制癫痫发作。促进致痫区异常放电神经元凋亡是伽马刀治疗癫痫机制之一。同时高剂量伽马刀照射造成的细胞凋亡大于低剂量伽马刀照射,有可能造成神经元缺失而降低治疗效果。故12Gy照射量为最佳。第四部分猫运动区癫痫模型伽玛刀照射前后γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)变化目的:对比不同剂量的伽玛刀照射前后不同时间点猫额叶运动区致痫灶的γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)的变化,探讨γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)与伽玛刀照射治疗运动功能区癫痫机制的关系。方法:在各个观察时间点,即致痫后2周、4周、8周、16周(即伽玛刀照射后8周)及32周(即伽玛刀照射后16周)五个时间点,每一只猫进行完前两部分的处理后,取标本匀浆离心后上清液置于-80℃冷冻保存待测,待标本收集齐全后,用高效液相色谱法检测脑组织γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)的变化情况。所有的数据均采用均数±标准差(x±s),用SAS统计软件进行分析比较,以P<0.01为差异有显著性。结果:在同一时间点,致痫模型组较正常对照组Glu升高,GABA降低;伽马刀照射组较致痫模型组Glu降低,GABA明显升高,低高剂量组间差异不大;但伽马刀照射组较正常对照组Glu仍稍高,GABA明显高于正常对照组。经统计学分析,致痫模型组与正常对照组、伽马刀照射组与致痫模型组差异有显著性(P<0.01)。每一个伽玛刀照射组在照射后不同时间点氨基酸的动态表达差异不大。结论:兴奋性氨基酸Glu升高、抑制性氨基酸GABA降低导致的兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸的失衡是癫痫发作机制之一;伽马刀照射则降低兴奋性氨基酸Glu,升高抑制性氨基酸GABA,从而建立兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸新的平衡,进而抑制癫痫发作。第五部分猫运动区癫痫模型伽玛刀照射前后NMDA受体亚基R1、R2A、R2B变化目的:对比不同剂量的伽玛刀照射前后不同时间点猫额叶运动区致痫灶的NMDA受体亚基R1、R2A、R2B的变化,探讨NMDA受体亚基R1、R2A、R2B与伽玛刀照射治疗运动功能区癫痫机制的关系。方法:在各个观察时间点,即致痫后2周、4周、8周、16周(即伽玛刀照射后8周)及32周(即伽玛刀照射后16周)五个时间点,每一只猫进行完前三部分的处理后,取标本制成石蜡切片,然后,用免疫组化的方法检测NMDA受体亚基R1、R2A、R2B的变化,所有的数据均采用均数±标准差(x±s),用SAS统计软件进行分析比较,以P<0.01为差异有显著性。结果:在同一时间点,致痫模型组较正常对照组NMDAR表达升高;伽马刀照射组较致痫模型组NMDAR表达降低,低高剂量组间差异不大;但伽马刀照射组较正常对照组NMDAR表达仍稍高。经统计学分析,致痫模型组与正常对照组、伽马刀照射组与致痫模型组差异有显著性(P<0.01)。每一个伽玛刀照射组在照射后不同时间点氨基酸的动态表达差异不大。结论:NMDA受体亚基R1、R2A、R2B的上调是癫痫发作机制之一;伽马刀照射则降低NMDA受体亚基R1、R2A、R2B含量,降低神经细胞兴奋性,进而抑制癫痫发作。
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