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黄粉虫抗肿瘤细胞K562抗菌肽的筛选纯化及体外抗K562实验研究

作　者: 刘颜岗
导　师: 赵瑞君
学　校: 山西医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 黄粉虫幼虫抗菌肽肿瘤细胞 K562 蛋白质纯化羟基脲细胞周期线粒体膜电位细胞凋亡
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：1.从黄粉虫幼虫体内分离纯化具有抗肿瘤细胞 K562(人慢性髓性白血病细胞)的抗菌肽,并对该抗菌肽进行分子鉴定。2.观察纯化的抗K562抗菌肽是否对人正常细胞293T(人肾上皮细胞)有杀伤作用；比较该抗菌肽与羟基脲对K562细胞的增殖抑制作用,判断抗菌肽抗肿瘤效果是否比羟基脲要好。3.观察黄粉虫抗菌肽对K562细胞周期的影响；观察黄粉虫抗菌肽对K562细胞线粒体膜电位及凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶-3 (caspase-3)的影响,从而探讨抗菌肽杀伤K562细胞的作用机制。方法：1.通过超声诱导黄粉虫幼虫大量表达抗菌肽,然后经过研磨、离心、固相萃取(solid phase extraction, SPE)、反相高效液相色谱(Reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)分离纯化黄粉虫幼虫抗菌肽,采用四甲基偶氮噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法和光镜观察法筛选对K562细胞有杀伤作用的抗菌肽。用高效液相色谱仪280nm紫外波长鉴定所提物质的蛋白质性；用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)对反相高效液相色谱法分离出来的对K562细胞有杀伤作用的抗菌肽进行分子鉴定。2.用MTT法检测筛选出来的抗菌肽峰9对人正常细胞293T细胞的作用。用MTT比色法分别求出不同浓度的抗菌肽峰9与羟基脲对K562的抑制率,根据浓度和抑制率用SPSS软件求出回归方程和半数抑制率(median inhibitory concentration, IC5o)。3.用流式细胞仪检测黄粉虫抗菌肽峰9对K562细胞周期的影响。以荧光探针罗丹明123负载,用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)观察黄粉虫抗菌肽峰9对K562细胞线粒体膜电位的影响。用caspase-3检测试剂盒和酶标仪测定caspase-3酶的活性。结果：1.取离心的上清液,上样固相萃取柱,用10%、30%、80%的乙腈水溶液洗脱,固相萃取各组分与PBS对照组方差分析具有统计学意义(F=43.502,P<0.01),其中用Dunnett-t法对各组分与对照组进行比较,只有80%的乙腈水溶液分离组分有活性(P<0.01)。该组分(命名为sp8组)的细胞相对抑制率(inhibition ratio, IR)为65.64%。在100倍光镜下观察：sp8组整个视野凌乱不堪,而对照组视野干净,两者形成鲜明的对比。400倍光镜下观察：sp8组细胞有的已经完全分解破碎；有的只剩下半个或多半个细胞,另外半个或少半个已经分解成碎片；有的细胞膜不完整,形成缺口,细胞内容物正在通过缺口向外释放；有的细胞发生变形,即将发生细胞分解。而对照组细胞几乎完整无缺。sp8活性组分经反相高效液相色谱纯化(214nm波长)后分离出24个峰物质,各峰与PBS对照组方差分析差异有统计学意义(F=12.801,P<0.01),其中用Dunnett-t法对各峰与对照组进行比较,峰1-4、9有活性(P<0.01)。这5个峰细胞相对抑制率分别为：42.21%、50.76%、63.86%、40.97%、47.86%。同时在280nm的波长下检测发现保留时间为22.003 min和15.469 min处有较强的吸收峰,这与214nm下的峰9的保留时间21.997 min和峰4的出峰的位置相符,而280nm是含有芳香族氨基酸蛋白质的特征吸收峰波长,故可认为峰9、峰4就是抗菌肽,其他3种有待于进一步的实验证明。在100倍和400倍光镜下观察反相高效液相色谱这5个峰物质作用于K562细胞后的图像与固相萃取sp8组图像相似。其中这5个峰之间在镜下也无明显差别。镜下观察见上。峰9、峰4经聚丙烯酰胺凝胶电泳后各得到一条清晰的蛋白条带,故峰9和峰4被确定为抗菌肽。2.峰9抗菌肽对人正常细胞293T的作用结果：抗菌肽组与PBS对照组经t-检验差异无统计学意义(t=1.395,P=0.236>0.05),说明抗菌肽对人正常细胞293T无杀伤作用。抗菌肽与羟基脲对K562细胞的增殖抑制作用结果：抗菌肽和羟基脲的回归方程分别为Y=-12.33+8.35X和Y=-6.98+1.96X,IC50分别为29.98μg/ml和3644.45μg/ml。我们看到两者的IC50相差很大,抗菌肽要远远小于羟基脲。说明抗菌肽的细胞增殖抑制作用要明显大于羟基脲。3.流式细胞仪检测抗菌肽峰9对K562细胞周期的影响结果：细胞周期G0／G1期和G2／M期细胞比例增加,S期细胞比例下降。其中G0／G1期和S期与PBS对照组相比,具有统计学意义(tG0/G1=7.19,P<0.01; tS=7.12, P<0.01)。说明抗菌肽可将细胞周期阻滞于G0／G1期,从而抑制了S期DNA的合成。抗菌肽峰9对K562细胞线粒体膜电位及caspase-3含量的影响结果：抗菌肽各个浓度组(16μg／ml、24μg／ml、32μg／ml、40μg／ml)与PBS对照组的罗丹明123荧光值方差分析差异有统计学意义(F=16.909,P<0.01),进一步经LSD-t检验,除16μg／ml组和24μg／ml组组间荧光值没有统计学意义之外,其余各组间均有统计学意义(P<0.05)。抗菌肽各组内随着浓度的递增,细胞数量递减,荧光值递减,荧光强度逐渐减弱。说明黄粉虫抗菌肽可使K562细胞线粒体膜电位降低。抗菌肽组caspase-3的含量明显高于PBS对照组,两者相比具有统计学意义(t=43.289,P=0.000<0.01)。结论：1.黄粉虫幼虫体内存在抗肿瘤细胞K562的抗菌肽和抗菌物质。我们得到峰9和峰4抗菌肽。它们的相对分子质量(Mr)约为6×103(国标规定,“分子质量”应换以“相对分子质量”,故将“相对分子质量”单位“1”替换了“Da”)。2.抗菌肽峰9对正常细胞几乎没有作用,这与多数报道的文献一致。抗菌肽对K562细胞的增殖抑制作用明显优于羟基脲,有大好的应用前景。3.黄粉虫抗菌肽峰9可能通过3种途径发挥抗肿瘤作用：(1)抑制S期DNA的合成进而影响细胞周期。(2)降低线粒体膜电位从而抑制细胞呼吸。(3)线粒体途径诱导细胞凋亡。

全文目录

缩略词  8-9
中文摘要  9-12
英文摘要  12-16
综述抗菌肽的抗肿瘤作用研究进展  16-23
  摘要  16
  Abstract  16
  1 抗菌肽的结构特点及特性  16-17
  2 抗菌肽对各类肿瘤细胞的抗肿瘤作用及其机制  17-19
  3 抗菌肽抗肿瘤作用的应用前景和存在的问题  19-20
  参考文献  20-23
实验一黄粉虫幼虫抗肿瘤细胞K562抗菌肽的分离纯化及其对人正常细胞293T的作用  23-39
  摘要  23
  Abstract  23-24
  前言  24
  材料与方法  24-29
  结果  29-35
  讨论  35-36
  参考文献  36-39
实验二黄粉虫抗菌肽对K562细胞周期的影响及MTT法比较其与羟基脲对K562增殖抑制作用  39-46
  摘要  39
  Abstract  39-40
  前言  40
  材料与方法  40-43
  结果  43-44
  讨论  44-45
  参考文献  45-46
实验三黄粉虫抗菌肽对K562细胞线粒体膜电位及caspase-3的影响  46-56
  摘要  46
  Abstract  46-47
  前言  47
  材料与方法  47-50
  结果  50-53
  讨论  53-54
  参考文献  54-56
附录  56-59
个人简介  59-60
致谢  60

黄粉虫抗肿瘤细胞K562抗菌肽的筛选纯化及体外抗K562实验研究

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