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约氏疟原虫CSP抑制肿瘤细胞增殖和存活及其机制研究

作 者: 丁艳
导 师: 徐文岳
学 校: 第三军医大学
专 业: 病原生物学
关键词: 环子孢子蛋白 核转录因子-κB 肿瘤细胞株 增殖 凋亡
分类号: R730.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


肿瘤是临床上导致患者死亡的主要原因。传统的手术切除和化放疗方法取得了一定的效果,然而,肿瘤的5年存活率仍然较低,因此,急需发展新的肿瘤治疗手段。NF-κB的持续活化是肿瘤细胞存活、增殖和迁移的重要机制,抑制NF-κB活性则是肿瘤治疗的重要策略之一。研究发现,侵入肝细胞的疟原虫子孢子的最主要表面蛋白—环子孢子蛋白CSP(circumsprozoites protein),利用其pexel功能域可由纳虫空泡进入胞浆内,抑制肝细胞NF-κB的活化和枯否氏细胞的呼吸爆炸,从而抑制肝脏局部的炎症反应,是肝期疟原虫不导致患者出现临床表现的重要原因之一。鉴此,我们推测疟原虫CSP可能通过阻断NF-κB的活化而抑制肿瘤细胞的增殖和存活。本研究首先构建了约氏疟原虫BY265株CSP重组质粒pFLAG-CMV8-CSP,采用Lipofactamine2000TM将其转染至人结肠癌细胞株SW480和肝癌细胞株HepG2,然后分别观察CSP对两种肿瘤细胞的存活和增殖的影响,并构建缺失核定位序列(Nuclear localization signal , NLS)的CSP和仅含有CSP核定位序列的重组质粒pFLAG-CMV8-CSPΔNLS和pFLAG-CMV8-CSP NLS,利用NF-κB报告基因试验观察转染后对两种肿瘤细胞NF-κB活化的影响;最后,采用凝胶迁移试验(EMSA)检测转染重组质粒pFLAG-CMV8-CSP后对NF-κB核转位的影响。结果发现:一、成功构建约氏疟原虫CSP真核表达质粒以约氏疟原虫BY265株子孢子总RNA为模板,用RT-PCR扩增CSP基因的编码区序列,获得1281bp的目的片段,并克隆至pFLAG-CMV8载体,经测序证实,成功构建了重组质粒pFLAG-CMV8-CSP。以兔抗CSP多克隆抗体间接免疫荧光法观察发现pFLAG-CMV8-CSP能在肿瘤细胞株SW480和HepG2中表达,并主要分布在胞浆内。二、CSP抑制肿瘤细胞增殖和存活1、CSP抑制肿瘤细胞的增殖:细胞增殖实验结果显示,在同等培养条件下,转染重组质粒pFLAG-CMV8-CSP的SW480和HepG2的增殖能力较对照组明显减弱,且随着重组质粒pFLAG- CMV8- CSP转染剂量递增而递减,说明CSP能以剂量依赖的方式抑制肿瘤细胞SW480和HepG2的增殖。2、CSP促进肿瘤细胞的凋亡Annexin V-FITC细胞凋亡实验结果显示,在同等培养条件下,转染重组质粒pFLAG-CMV8-CSP的HepG2细胞的凋亡率较对照组明显升高(p<0.01),提示CSP能促进HepG2细胞凋亡。三、CSP的NLS竞争NF-κB核转位抑制NF-κB的活化1、CSP通过NLS抑制肿瘤细胞NF-κB的活化:以重组质粒pFLAG-CMV8-CSP为模板,构建缺失核定位序列(Nuclear localization signal,NLS)的CSP和仅含有CSP核定位序列的重组质粒pFLAG-CMV8-CSPΔNLS和pFLAG-CMV8-CSP NLS。NF-κB报告基因试验发现,除了pFLAG-CMV8-CSPΔNLS外,pFLAG-CMV8-CSP和pFLAG-CMV8-CSP NLS均能明显地抑制两种肿瘤细胞NF-κB的活化。2、CSP竞争抑制肿瘤细胞的NF-κB核转位:凝胶迁移试验结果显示,转染重组质粒pFLAG-CMV8-CSP组条带较对照组明显减弱,提示CSP能抑制SW480细胞和HepG2细胞NF-κB核转位。综上所述,本研究成功构建了约氏疟原虫BY265株CSP重组质粒pFLAG-CMV8- CSP,探讨了CSP抑制人结肠癌细胞株SW480和人肝癌细胞株HepG2的存活与增殖及其机制。研究结果显示,CSP能抑制肿瘤细胞株SW480和HepG2的增殖,并促进两种肿瘤细胞株的凋亡,其机制可能是CSP的NLS通过竞争SW480和HepG2细胞的NF-κB核转位,抑制NF-κB的活化而实现的。这为进一步研究CSP对肿瘤细胞迁移的影响以及肿瘤的生物治疗奠定了基础。

全文目录


英文缩写一览表  4-6Abstract  6-8摘要  8-10前言  10-12第一部分 约氏疟原虫CSP 真核表达质粒的构建及表达  12-26  材料与方法  12-22  结果  22-24  讨论  24-26第二部分 CSP 对肿瘤细胞存活和增殖的影响  26-32  材料与方法  26-28  结果  28-31  讨论  31-32第三部分 CSP 抑制肿瘤细胞存活和增殖的分子机制  32-47  材料与方法  32-42  结果  42-46  讨论  46-47全文结论  47-48致谢  48-49参考文献  49-52文献综述 抑制NF-κB 活化治疗肿瘤的研究现状  52-61  参考文献  57-61攻读硕士期间申请的专利以及已发表和拟发表论文  61

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤治疗学
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