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家蝇幼虫抗菌肽defensin基因的克隆、表达、纯化及抑菌、抑肿瘤活性研究

作　者: 焦莉萍
导　师: 赵瑞君
学　校: 山西医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 防御素生物信息学分析基因克隆原核表达蛋白纯化羟基脲细胞周期细胞凋亡 SW480 SIHA HepG2
分类号: R384.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

实验目的1.在实验研究过程中我们对家蝇抗菌肽防御素(defensin)基因进行生物信息学的分析；并应用分子生物学方法从家蝇幼虫体内提取抗菌肽防御素(defensin)基因，并对该基因进行克隆、表达与纯化。2.鉴定已纯化的家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)部分对大肠杆菌E.coliK12D31的抑制作用；观察抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肿瘤细胞HepG2,SIHA,SW480和对人正常心肌细胞H9C2的抑制及杀伤作用；比较该防御素成熟肽(MD)与羟基脲分别对肝癌细胞HepG2的作用效果。3.观察家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肝癌细胞HepG2细胞周期的影响；观察家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肝癌细胞HepG2细胞凋亡的影响；观察家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽(MD)对肝癌细胞HepG2凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的影响，从而探究抗菌肽防御素成熟肽(MD)杀伤肝癌细胞HepG2的作用机制与原理。实验方法我们对家蝇抗菌肽防御素(defensin)基因的主要特性进行生物信息学的分析。应用蛋白质分析专家系统（ExPASy）上的SOSUI、 ProtParam、HNN、TMHMM、MotifScan和NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息学在线分析软件进行分析，并结合DNAman、Gene Runner等生物信息学分析软件进行分析、预测家蝇抗菌肽防御素defensin蛋白的可溶性及理化性质、翻译后修饰位点、跨膜区、亲（疏）水性、二级结构、三级结构及同源性分析，以及遗传关系的比对等。在Genbank中检索家蝇defensin基因，根据其设计特异性引物，我们在家蝇幼虫组织中提取RNA,并通过PCR聚合酶链反应扩增defensin基因成熟肽部分(Mature defensin, MD)，并将该基因与原核质粒表达载体pGEX-6P-1进行质粒重组，构建家蝇抗菌肽重组蛋白pGEX-6P-1/MD。通过双酶切鉴定证明目的片段已稳定融合到载体pGEX-6P-1中并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中，经25℃IPTG诱导在大肠杆菌E.Coli DH5ɑ中表达，用GST-Sefinose亲和层析纯化蛋白，表达产物经15%SDS-PAGE分析鉴定。应用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法求出不同浓度抗菌肽MD对SW480，SIHA，HepG2肿瘤细胞的抑制率及对人心肌细胞H9C2的抑制作用。用MTT法对不同浓度抗菌肽防御素作肿瘤细胞的生长曲线。采用MTT比色法分别求出不同浓度抗菌肽防御素与羟基脲对肝癌细胞HepG2的抑制率，依据药物浓度和抑制率用SPSS软件求出防御素和羟基脲的半数抑制率(median inhibitory concentration，IC50)和回归方程。我们采用AnnexinV-Fitc-PI双染凋亡检测试剂盒检测抗菌肽防御素MD，检测它能否引起肝癌细胞HepG2的细胞凋亡。我们用流式细胞仪检测抗菌肽防御素MD，观察它对肝癌细胞HepG2细胞周期及凋亡的影响。本实验室应用caspase-3检测试剂盒与酶标测定仪检测该蛋白caspase-3酶的活性。实验结果我们通过生物信息学分析defensin蛋白由92个氨基酸组成，该蛋白的分子式为C435H670N126O124S9,它的分子质量单位为9.9374ku，计算它的等电点理论值为8.75，检测波长280nm时的吸光度（A）值为0.637，半衰期为30h，该蛋白具有4个翻译后修饰位点。家蝇防御素与其他三种蝇科昆虫防御素同源性较近。以家蝇幼虫抗菌肽防御素成熟肽MD的cDNA为摸板进行扩增后获得的碱基长度为142bp的defensin基因片段，本实验成功构建重组质粒pGEX-6P-1/MD;之后菌液通过IPTG诱导后进行SDS-PAGE胶进行分析，实验结果显示了在大肠杆菌BL21（DE3）中防御素成熟肽MD基因片段高效表达，它的相对分子量（Mr）约30kDa。本实验抑菌实验结果显示家蝇幼虫抗菌肽防御素对大肠杆菌E. coli K12D31有抑杀作用；我们用MTT法检测显示六种不同浓度（30μg/ml,60μg/ml,120μg/ml,360μg/ml,680μg/ml,1000μg/ml）抗菌肽防御素MD对SW480，SIHA，HepG2肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，实验结果与正常对照组比较结果具有统计学意义(p<0.05)；这六种不同浓度抗菌肽防御素对人心肌细胞H9C2均无较明显抑制作用，其实验结果与正常对照组相比较无统计学意义(p>0.05)；三种肿瘤细胞SW480，SIHA，HepG2在不同浓度抗菌肽防御素MD作用下生长受到明显抑制，防御素浓度和作用时间对细胞的抑制作用呈剂量反应关系；经计算防御素与羟基脲的回归方程分别为=-1.566+0.529x和=-2.342+0.597x，它们的IC50半数抑制率分别是909μg/ml和8416μg/ml，结果显示两者的IC50相差较大，那么表明防御素的细胞增殖抑制作用比羟基脲高。用流式细胞仪检测抗菌肽防御素MD对人肝癌细胞HepG2细胞周期的影响结果：结果显示GI期与M期的细胞比例有所增加，而S期细胞比例反而下降。显示结果中只有GI期和S期与PBS对照组相比具有统计学意义(p<0.01)，说明抗菌肽防御素MD使HepG2细胞周期在GI期停滞致使S期DNA的合成受到抑制。SW480，SIHA，HepG2这几种肿瘤细胞之间的增殖抑制率在不同浓度组抗菌肽防御素MD作用下均无统计学意义(p>0.05)。抗菌肽防御素MD对HepG2细胞caspase-3含量的影响结果：防御素组caspase-3的含量高于PBS对照组，两者比较差异具有统计学意义。结论通过生物信息学发现家蝇幼虫抗菌肽防御素defensin基因具有其特定的结构，可能具有抗菌活性及其他生物学活性；家蝇抗菌肽融合蛋白pGEX-6P-1/MD被成功克隆和表达，证明这三种肿瘤细胞SW480，SIHA，HepG2都能被纯化蛋白MD抑制杀伤，这为以后研发家蝇抗菌肽防御素类药物提供了依据。抗菌肽防御素MD能够抑制大肠杆菌生长繁殖活性；SW480，SIHA，HepG2三种肿瘤细胞均能被抗菌肽MD所抑制，但正常人体心肌细胞H9C2不能被其抑制；抗菌肽防御素比羟基脲对HepG2细胞具有更好的增殖抑制作用；SW480，SIHA，HepG2肿瘤细胞的抑制作用与抗菌肽MD呈剂量效应关系；将传统抗肿瘤药物与家蝇抗菌肽防御素MD比较，家蝇抗菌肽MD既能有效杀伤肿瘤细胞，又不损伤正常人体心肌细胞H9C2；家蝇抗菌肽MD可能通过两种途径发挥抑制肿瘤作用：肝癌细胞HepG2细胞周期受到抑制S期DNA的合成的影响；经线粒体途径诱导肝癌细胞HepG2细胞凋亡。

全文目录

缩略词  6-8
中文摘要  8-12
ABSTRACT  12-17
第一章综述  17-31
  参考文献  27-31
第二章家蝇防御素 DEFENSIN 生物信息学分析  31-43
  摘要  31
  Abstract  31-32
  材料与方法  32-33
  结果  33-39
  讨论  39-41
  参考文献  41-43
第三章家蝇幼虫抗菌肽防御素基因的克隆原核表达、纯化及抑菌、抑肿瘤活性鉴定  43-66
  摘要  43
  Abstract  43-44
  前言  44-45
  材料与方法  45-54
  结果  54-62
  讨论  62-64
  参考文献  64-66
第四章家蝇幼虫抗菌肽 MD 对 SW480，SIHA，HEPG2 等肿瘤细胞的抑制作用研究  66-84
  摘要  66-67
  abstract  67-69
  前言  69-70
  材料与方法  70-74
  结果  74-79
  讨论  79-82
  参考文献  82-84
附录  84-95
已发文章  95-96
致谢  96-97
个人简历  97

家蝇幼虫抗菌肽defensin基因的克隆、表达、纯化及抑菌、抑肿瘤活性研究

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