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军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达

作　者: 郝羽
导　师: 刘楚吾
学　校: 广东海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 军曹鱼 生长激素 基因克隆 大肠杆菌 表达
分类号: Q786
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


生长激素(Growth Hormone)是GH/PRL/SL家族的一个成员,其功能是对鱼类的生长发育、繁殖等起着非常重要的调控作用。DNA重组技术为GH基因重组提供了可能性,实现了外源生长激素在鱼体中的促生长作用。本论文以军曹鱼为研究对象,对该鱼的生长激素(GH)基因进行克隆和原核表达,并对GH基因在军曹鱼各组织中的表达分布进行了分析。根据鲈形目GH基因氨基酸序列的同源性设计了一对简并性引物来扩增军曹鱼脑垂体cDNA,获得了军曹鱼GH基因cDNA片段后用同源克隆的方法获得了军曹鱼GH基因3’和5’非编码区域,进而得到军曹鱼GH基因全长cDNA序列。最后通过设计特异性引物扩增军曹鱼脑垂体基因组DNA,获得了内含子的序列。该基因序列全长1780bp,其中5’端非编码区为(5’-UTR)77 bp,3’端非编码区(3’-UTR)为170 bp,整个开放阅读框(OFR)长1533 bp,包括5个外显子和4个内含子,cDNA序列全长615 bp,编码204个氨基酸,其中含22个信号肽和182个成熟肽,预测分子量约为23.17 kDa,理论等电点为6.43。氨基酸序列比对发现,军曹鱼GH基因与哺乳动物和四脚动物的同源性低于40%,与鲈形目鱼类的同源性高于80%,其中与鲯鳅的同源性最高,同源性达到97.5%。生长激素是生长轴(GH-IGF-1)的重要组成部分,它控制鱼类的生长和发育。生长激素通过结合肝细胞膜受体后在许多组织中起作用,本研究通过实时荧光定量PCR方法,分析了GH基因在成体军曹鱼10个组织的表达差异,结果表明,GH基因在军曹鱼脑垂体中表达量最高,其次是性腺,而在肝脏,脑,心脏,肾脏,脾脏,胃,肌肉和鳃中有极少的表达量。采用T-A克隆构建pMD18-T-CoGH重组质粒,测序正确后经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切获得CoGH片段,插入表达载体pET-28a,转化到大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中进行表达,表达产物通过SDS-PAGE显示为分子量23kDa的蛋白条带,经过western blotting检测后发现目的蛋白与His抗体特异性结合,证明目的基因在大肠杆菌中成功表达。本实验优化了GH基因在大肠杆菌中的表达条件,从宿主菌、诱导温度、诱导时间、诱导剂的浓度等方面进行优化,实验显示军曹鱼GH基因在宿主菌BL21中不表达,而在BL21(DE3)中则大量表达。该基因在温度为37℃,诱导剂IPTG的终浓度为1 mmol/L时诱导4 h,蛋白的表达量最大,但可溶性较差。通过超声波破碎实验证明该基因随着温度的降低蛋白的可溶性逐渐提高,在25℃时诱导有较好的效果。

全文目录


摘要  6-8Abstract  8-121 文献综述  12-23  1.1 生长激素的研究进展  12-14    1.1.1 生长激素的结构及同源性比较  12-13    1.1.2 生长激素的生理作用  13-14  1.2 鱼类生长激素的研究现状  14-18    1.2.1 鱼类生长激素的结构  15    1.2.2 鱼类生长激素的生理功能  15-16    1.2.3 鱼类生长激素的分泌和调节  16-18  1.3 鱼类生长激素基因的研究现状  18-21    1.3.1 鱼类GH 基因的分子结构  18-19    1.3.2 鱼类GH 基因多态性的研究  19    1.3.3 鱼类GH 基因的异源表达  19-21  1.4 本文研究的目的与意义  21-232 军曹鱼生长激素基因(GH)的克隆及序列分析  23-35  2.1 实验材料  23-24    2.1.1 动物材料  23    2.1.2 主要试剂  23    2.1.3 菌株和质粒  23    2.1.4 主要仪器设备  23-24    2.1.5 溶液及其配制方法  24    2.1.6 培养基及其配制方法  24  2.2 实验方法  24-29    2.2.1 军曹鱼生长激素(GH)基因全长cDNA 的获得  24-26    2.2.2 军曹鱼生长激素(GH)基因组DNA 的获得  26    2.2.3 RT-PCR 产物的回收和连接  26-27    2.2.4 DH5α感受态的制备和转化  27-28    2.2.5 菌液PCR 鉴定阳性克隆和序列测定  28    2.2.6 序列分析  28-29  2.3 结果  29-33    2.3.1 军曹鱼GH 基因cDNA 全长的获得  29    2.3.2 军曹鱼GH 基因序列分析  29-30    2.3.3 军曹鱼GH 基因结构分析  30-31    2.3.4 军曹鱼GH 基因的同源性分析及系统树的构建  31-33  2.4 讨论  33-353 GH 基因在军曹鱼各组织中的差异表达  35-38  3.1 实验材料  35  3.2 实验方法  35-36    3.2.1 引物设计  35    3.2.2 各组织cDNA 模板的制备  35    3.2.3 荧光定量PCR  35    3.2.4 数据统计和分析  35-36  3.3 结果  36  3.4 讨论  36-384 军曹鱼生长激素（GH）基因的原核表达  38-52  4.1 实验材料  38-39    4.1.1 主要试剂  38    4.1.2 载体和菌株  38    4.1.3 仪器  38    4.1.4 溶液及其配制方法  38-39  4.2 实验方法  39-44    4.2.1 军曹鱼GH 原核表达载体的构建  39-42    4.2.2 重组GH 在大肠杆菌中的表达  42-44  4.3 结果  44-50    4.3.1 军曹鱼GH 基因编码区cDNA 的扩增  44-45    4.3.2 表达载体的构建  45-46    4.3.3 表达产物的确定  46-47    4.3.4 表达条件的优化  47-49    4.3.5 融合蛋白的Western-blotting 检测  49-50  4.4 讨论  50-525 结论  52-53参考文献  53-61致谢  61-62作者简介  62-63导师简介  63

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因的表达
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