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β-防御素1基因在小鼠乳腺组织中表达的研究

作　者: 孟丽丽
导　师: 钟凯
学　校: 河南农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 小鼠乳腺组织 β-防御素1 LPS
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

β-防御素具有广谱的抗菌活性且是宿主固有防御的重要参与者,在奶牛乳腺炎防治方面具有广阔的应用前景。为了研究β-防御素1(β-defensin 1,Defb1)基因在小鼠乳腺中的表达情况,本文以小鼠第四对乳腺组织为研究对象,用半定量RT-PCR法探讨了小鼠乳腺发育周期(妊娠、泌乳、退化)中Defb1基因的表达规律及大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠乳腺炎时乳腺中Defb1基因表达的差异。一、Defb1基因在小鼠乳腺组织中的表达。利用Genbank上已公布的小鼠Defb1基因序列,设计一对引物,小鼠乳腺组织提取总RNA进行RT-PCR,将PCR产物与pMD-19T载体连接后转化到DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆、测序,并进行序列比对。结果表明: Defb1基因在小鼠乳腺组织中有表达。二、小鼠乳腺发育周期中Defb1基因的表达规律。分别取小鼠妊娠1d、6d、12d、18d;泌乳1d、6d、12d、18d;21天自然断乳0d、1d、2d、3d、4d、5d的乳腺组织,采用半定量RT-PCR法进行研究。结果显示:随着妊娠的进行Defb1转录水平逐渐升高,且各时期差异显著,妊娠18d转录水平最高;在泌乳过程中,Defb1转录水平呈下降趋势,与泌乳1d相比,泌乳6d时Defb1mRNA水平下调,但差异不显著,妊娠12d,18d Defb1的转录水平显著下降;自然断乳后Defb1基因表达量呈现先下降后上升再下降的变化趋势,与0d相比,断乳后第1d和第2d mRNA水平即显著降低,3d时Defb1转录水平出现显著升高,达到峰值。此后4d,5d Defb1 mRNA水平又下降。三、Defb1基因在LPS诱导的小鼠乳腺炎中的表达差异。按1.4μg/只剂量在泌乳10d母鼠第四对乳腺基部注射LPS,诱导小鼠乳腺炎。分别取注射LPS前(0h)和注射后6h、9h、12h、24h乳腺组织,采用半定量RT-PCR法研究Defb1表达量差异。结果显示:与0h相比,诱导后各时期Defb1基因的表达量均显著增加,诱导后的6h,9h Defb1转录水平显著上调,9h时达到最高峰。与9h相比,诱导后12h、24h Defb1转录水平都显著降低,12h和24h Defb1基因的表达量差异不显著。

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致谢 4-9摘要 9-101. 文献综述 10-23 1.1 乳腺结构特点 10-12 1.1.1 乳腺解剖学结构 10 1.1.2 乳腺的生理周期变化 10-12 1.1.2.1 乳腺在妊娠期的发育 10-11 1.1.2.2 乳腺在泌乳期的发育 11 1.1.2.3 乳腺退化 11-12 1.2 奶牛乳腺炎研究 12-14 1.2.1 乳腺炎的种类及其特征 12 1.2.2 乳腺炎病因 12-13 1.2.3 乳腺炎的预防和治疗 13-14 1.2.3.1 乳腺炎的预防 13 1.2.3.2 乳腺炎的治疗方法 13-14 1.3 乳腺生理防御 14-18 1.3.1 物理性防御 14-15 1.3.2 细胞防御 15-16 1.3.2.1 巨噬细胞 15 1.3.2.2 嗜中性粒细胞 15-16 1.3.2.3 淋巴细胞 16 1.3.2.4 乳腺上皮细胞 16 1.3.3 体液防御 16-18 1.3.3.1 免疫球蛋白 17 1.3.3.2 补体 17 1.3.3.3 乳铁蛋白 17-18 1.3.3.4 转铁蛋白和溶菌酶 18 1.4 防御素研究进展 18-23 1.4.1 防御素的分子特征 19 1.4.2 防御素的生物活性 19-20 1.4.2.1 抗菌作用 19 1.4.2.2 抗病毒作用 19-20 1.4.2.3 免疫调节作用 20 1.4.2.4 细胞毒作用 20 1.4.2.5 趋化效应 20 1.4.3 防御素的应用 20-21 1.4.3.1 防御素在畜牧业中的应用 20-21 1.4.3.2 防御素的临床药用及动物抗病育种中研究 21 1.4.4 Β-防御素在乳腺中的研究进展 21-232 引言 23-243 材料与方法 24-32 3.1 小鼠乳腺发育周期中Defb1 基因表达规律的研究 24-28 3.1.1 小鼠乳腺组织中Defb1 mRNA 水平的检测 24-26 3.1.1.1 试验动物及分组 24 3.1.1.2 乳腺组织采集 24 3.1.1.3 主要仪器和试剂 24 3.1.1.4 引物设计及合成 24 3.1.1.5 乳腺组织总RNA 的提取及检测 24-25 3.1.1.6 看家基因和目的基因PCR 产物获得 25 3.1.1.7 PCR 产物纯化回收 25-26 3.1.1.8 连接和转化 26 3.1.1.9 DNA 序列测定 26 3.1.2 妊娠期小鼠乳腺中Defb1 基因表达规律的研究 26-27 3.1.2.1 实验动物分组及处理 26-27 3.1.2.2 主要试剂和仪器 27 3.1.2.3 引物设计及合成 27 3.1.2.4 乳腺组织总RNA 的提取及检测 27 3.1.2.5 看家基因和目的基因PCR 产物获得 27 3.1.2.6 PCR 产物纯化回收 27 3.1.2.7 连接和转化 27 3.1.2.8 DNA 序列测定 27 3.1.2.9 指标测定 27 3.1.2.10 数据统计 27 3.1.3 泌乳期小鼠乳腺中Defb1 基因表达规律的研究 27-28 3.1.3.1 实验动物分组及处理 27 3.1.3.2 主要试剂和仪器 27 3.1.3.3 引物设计及合成 27 3.1.3.4 乳腺组织总RNA 的提取及检测 27 3.1.3.5 看家基因和目的基因PCR 产物获得 27 3.1.3.6 PCR 产物纯化回收 27 3.1.3.7 连接和转化 27 3.1.3.8 DNA 序列测定 27-28 3.1.3.9 指标测定 28 3.1.3.10 数据统计 28 3.1.4 退化期小鼠乳腺中Defb1 基因表达规律的研究 28 3.1.4.1 实验动物分组及处理 28 3.1.4.2 主要试剂和仪器 28 3.1.4.3 引物设计及合成 28 3.1.4.4 乳腺组织总RNA 的提取及检测 28 3.1.4.5 看家基因和目的基因PCR 产物获得 28 3.1.4.6 PCR 产物纯化回收 28 3.1.4.7 连接和转化 28 3.1.4.8 DNA 序列测定 28 3.1.4.9 指标测定 28 3.1.4.10 数据统计 28 3.2 LPS 诱导的乳腺炎对小鼠乳腺中Defb1 基因表达的影响 28-32 3.2.1 LPS 诱导小鼠乳腺炎 28-29 3.2.1.1 主要试剂和仪器 28 3.2.1.2 实验动物分组及处理 28-29 3.2.2 小鼠乳腺病理切片 29-31 3.2.2.1 主要试剂和仪器 29 3.2.2.2 切片制作步骤 29-31 3.2.3 LPS 诱导后小鼠乳腺中Defb1 基因表达差异 31-32 3.2.3.1 实验动物分组及处理 31 3.2.3.2 主要试剂和仪器 31 3.2.3.3 引物设计及合成 31 3.2.3.4 乳腺组织总RNA 的提取及检测 31 3.2.3.5 看家基因和目的基因PCR 产物获得 31 3.2.3.6 PCR 产物纯化回收 31 3.2.3.7 连接和转化 31 3.2.3.8 DNA 序列测定 31 3.2.3.9 指标测定 31 3.2.3.10 数据统计 31-324 结果与分析 32-39 4.1 小鼠乳腺发育周期中Defb1 基因表达规律的研究 32-37 4.1.1 小鼠乳腺中 Defb1 mRNA 水平的检测 32 4.1.1.1 小鼠乳腺中Defb1 基因片段长度 32 4.1.1.2 RT-PCR 产物的测序及序列分析结果 32 4.1.2 妊娠期小鼠乳腺中Defb1 基因表达规律的研究 32-34 4.1.3 泌乳期 Defb1 基因表达规律的研究 34-35 4.1.4 退化期小鼠乳腺中Defb1 基因表达规律的研究 35-36 4.1.5 小鼠乳腺发育周期中 Defb1 基因表达总趋势 36-37 4.4 Defb1 在LPS 诱导的乳腺炎中的表达差异 37-39 4.4.1 小鼠乳腺病理切片 37 4.4.2 Defb1 在LPS 诱导的乳腺炎中的表达差异 37-395 讨论与结论 39-42 5.1 讨论 39-41 5.1.1 小鼠乳腺组织中 Defb1 基因的表达 39 5.1.2 小鼠乳腺发育周期中Defb1 基因表达规律 39-40 5.1.2.1 妊娠、泌乳期小鼠乳腺中 Defb1 基因表达规律 39-40 5.1.2.2 退化期小鼠乳腺中 Defb1 基因表达规律 40 5.1.3 Defb1 在LPS 诱导的乳腺炎中的表达差异 40-41 5.2 结论 41-42参考文献 42-47Abstract 47

β-防御素1基因在小鼠乳腺组织中表达的研究

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