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多菌灵降解菌的分离鉴定、生物学特性及多菌灵水解酶基因的克隆和表达研究

作　者: 龚芬芬
导　师: 洪青
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 多菌灵 分离鉴定 生物降解 多菌灵水解酶基因 克隆和表达
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


从长期施用多菌灵的土壤中分离得到两株多菌灵降解菌mbc-1和mbc-2,根据生理生化特征分析及16S rRNA基因相似性序列比较,分别将其鉴定为Mycobacterium sp. (GenBank Accession No.HQ873672)和Nocardioides sp. (GenBank Accession No.JF937914)。菌株mbc-1和mbc-2在pH值为6.0～8.0,生长良好,最适pH均为7.0。mbc-1和mbc-2的最适生长温度均为30℃。mbc-1和mbc-2的最适生长碳源为葡萄糖,最适有机氮源均为酵母膏,mbc-1的最适无机氮源为硝酸钾,而mbc-2的最适无机氮源为尿素。菌株mbc-1和mbc-2均能以多菌灵为唯一碳源生长,在多菌灵浓度为50mg-L-1的无机盐培养基中,mbc-1和mbc-2在84h之内对其降解率分别为97.9%和86.1%。mbc-1和mbc-2降解多菌灵的最适温度均为30℃,最适pH均为7.0。对菌株mbc-1和mbc-2代谢多菌灵途径的初步研究显示,它们首先将多菌灵转化为2-氨基苯并咪唑然后进一步转化为2-羟基苯并咪唑,直至完全降解。根据已报道的多菌灵水解酶基因(mheI)设计引物,通过PCR的方法从mbc-1和mbc-2中克隆了该基因。序列测定和比对结果显示,它们与已报道的唯一的多菌灵水解酶基因mheI(Nocardioides sp. SG-4G, GQ454794.1)基因同源性均为99%。将该基因构建到表达载体pET29a上,转化到E.coli BL21(DE3)中进行了表达,得到了分子量符合预期大小的蛋白质(24.3KD),该蛋白具有多菌灵水解酶活性。基于多菌灵水解酶基因序列在几株菌中高度保守,为了研究其是否和基因水平转移元件相连,我们通过染色体步移(chromosome walking)的方法,分别从mbc-1和mbc-2中获得了mhel基因上游和下游DNA片段,拼接后大小为5983bp和4529bp,其中mbc-1包括orfl (与alcohol dehydrogenase相似性最大,为57%),orf2(与L-asparaginaseⅡ相似性最大,为92%),orf3(与binding-protein dependent transport system inner membrane protein相似性最大,为96%),orf4(与ABC transporter-like protein相似性最大,为95%)；mbc-2包括orfl(与L-asparaginaseⅡ相似性最大,为92%),orf2,orf3(与alcohol dehydrogenase相似性最大,为34%),orf4(与ABC transporter permease protein相似性为79%)orf5(与ABC transporter-like protein相似性最大,为95%)。现有结果没有发现和基因水平转移相关的证据,但是还有待进一步研究。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11符号与缩略语说明  11-12前言  12-13第一章 文献综述  13-25  1 多菌灵概述  13-17    1.1 多菌灵的理化性质  13-14    1.2 多菌灵的杀菌机理及生产使用情况  14    1.3 多菌灵的毒性  14-16    1.4 多菌灵残留的情况及相关标准  16    1.5 多菌灵的检测方法  16-17  2 多菌灵的降解研究  17-20    2.1 多菌灵的物理化学降解研究  17-18    2.2 多菌灵的生物降解研究  18-20  3 本研究的目的和内容  20-21  参考文献  21-25第二章 多菌灵降解菌的分离和生物学特性研究  25-41  1 材料与方法  25-27    1.1 培养基与试剂  25    1.2 多菌灵降解菌的分离  25-26    1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定  26    1.4 降解菌株16S rRNA基因序列的测定  26-27    1.5 降解菌株系统发育地位的确定  27    1.6 菌体生长量的测定  27    1.7 多菌灵的含量测定  27  2 结果与讨论  27-38    2.1 多菌灵降解菌株的分离  27-28    2.2 降解菌株mbc-1和mbc-2的菌落形态及生理生化特征  28-29    2.3 菌株mbc-1和mbc-2的16S rRNA基因扩增  29-30    2.4 降解菌株mbc-1和mbc-2的鉴定结果  30-32    2.5 环境条件对降解菌株mbc-1和mbc-2生长的影响  32-37    2.6 菌株mbc-1和mbc-2的抗性谱  37-38  3 小结  38-39  参考文献  39-41第三章 多菌灵降解菌的降解特性及代谢途径研究  41-53  第一节 菌株mbc-1、mbc-2降解多菌灵的特性研究  41-47    1 材料与方法  41-42      1.1 供试菌株、培养基与试剂  41-42      1.2 菌体生长量的测定  42      1.3 多菌灵的含量测定  42      1.4 种子液培养  42    2 结果与讨论  42-46      2.1 菌株mbc-1和mbc-2的生长和多菌灵降解的关系  42-43      2.2 多菌灵起始浓度对mbc-1和mbc-2降解多菌灵的影响  43-44      2.3 温度对菌株mbc-1、mbc-2降解多菌灵的影响  44-45      2.4 pH对菌株mbc-1和mbc-2降解多菌灵的影响  45-46    3 小结  46-47  第二节 菌株mbc-1和mbc-2降解多菌灵途径分析  47-52    1 材料与方法  47      1.1 培养基与试剂  47      1.2 代谢产物提取  47    2 结果与讨论  47-51      2.1 多菌灵代谢产物的HPLC初步检测  47-50      2.2 2-氨基和2-羟基苯并咪唑的降解研究  50-51      2.3 代谢途径的推测  51    3 小结  51-52  参考文献  52-53第四章 多菌灵降解酶基因(mheⅠ)的克隆及表达  53-63  1 材料和方法  53-58    1.1 培养基与试剂  53    1.2 菌株与质粒  53-54    1.3 菌体基因组DNA的提取  54    1.4 质粒DNA的小量提取  54    1.5 普通感受态细胞的制备  54-55    1.6 多菌灵降解酶基因的引物设计和PCR扩增  55    1.7 PCR产物的纯化及酶切  55-56    1.8 表达载体pET29a的制备  56    1.9 酶连及酶连产物的转化  56    1.10 阳性克隆筛选  56    1.11 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析  56-57    1.12 酶活分析  57-58  2 结果与讨论  58-61  3 小结  61-62  参考文献  62-63第五章 多菌灵降解酶基因(mheⅠ)的侧翼序列扩增及分析  63-69  1 材料与方法  63-65  2 结果与讨论  65-67  3 小结  67-68  参考文献  68-69全文总结  69-71附录一 文中所用培养基及试剂配方  71-73附录二 相关DNA序列  73-81攻读硕士学位期间发表或已接收的学术论文  81-83致谢  83

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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