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红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析

作　者: 张媛
导　师: 简纪常
学　校: 广东海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 红笛鲷 清道夫受体 抗冻蛋白 基因克隆 原核表达 表达分析
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 9次
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内容摘要


本论文以红笛鲷(Lutjanus sanguineus)为实验对象,根据NCBI上已经登录的已知序列,设计特异性简并引物,利用RACE技术,获得了道夫受体B型Ⅰ类(Scavenger Receptor class B typeⅠ,SR-BⅠ)和抗冻蛋白Ⅱ型(Antifreeze ProteinsⅡ,AFPⅡ)基因全长,并对其进行了生物信息学分析。结果表明:SR-BⅠ基因的cDNA开放阅读框长度为966bp,编码一个由233个氨基酸残基组成的蛋白质,其分子量计算值为36.735kDa,理论等电点(PI)为8.75;红笛鲷AFPⅡ基因的cDNA序列全长990bp,开放阅读框(ORF)609bp,编码一个由203个氨基酸残基组成的蛋白质,其分子量计算值为22.45kDa,理论等电点为5.52。在克隆AFPⅡ全长的基础上,构建了原核表达载体pET- AFPⅡ,将其导入大肠杆菌BL21后进行蛋白的表达条件的筛选。通过对诱导时间、IPTG浓度的优化,最终确定AFPⅡ蛋白在大肠杆菌中诱导表达优化条件为:IPTG浓度为0.7mmol/L,37℃诱导3h。用Real-time PCR对溶藻弧菌免疫后红笛鲷S R-BⅠ基因在不同组织里的表达水平差异进行研究,结果发现,经溶藻弧菌免疫后S R-BⅠ在红笛鲷的头肾、脾脏、肝脏、肠、心脏、胸腺组织中的表达量均有变化,其中肠中表达量明显高于其他组织,肝脏次之,然后依次是头肾、心脏、脾脏,胸腺中表达量最少。利用Real-time PCR研究了水温对AFPⅡ表达量的影响。选择3条健康红笛鲷放入17℃养殖池中30min,以水温25℃为对照组,提取头肾、胸腺、肝脏、脾脏、鳃、肠六个组织总RNA,结果发现,低温刺激后各个组织的表达量均有所变化,肠和肝脏的AFPⅡ表达量都是实验组大于对照组,而头肾、胸腺、脾脏、鳃中则是对照组的表达量大于实验组。本论文主要是在红笛鲷SR-BⅠ和AFPⅡ基因的克隆和表达内容上进行了研究与探讨,实验结果为红笛鲷脂肪代谢疾病的防治提供一定的理论依据,也为进一步研究AFPⅡ在鱼类转基因抗冻方面奠定基础。

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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