学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰

作　者: 汪丹
导　师: 吴益东
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 棉铃虫 NDPH-细胞色素P450还原酶 基因克隆 时空表达 RNA干扰
分类号: S435.622.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 25次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


棉铃虫Helicoverpa armigera (Hiibner)是一种世界性的重要经济害虫。自20世纪八十年代以来,高效、低毒的拟除虫菊酯类杀虫剂被广泛用于防治棉铃虫。然而,由于杀虫剂频繁且不合理的使用,棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性水平逐年提高,并成为引起90年代初我国北方棉区棉铃虫大暴发的重要原因之一。抗性机理研究表明细胞色素P450氧化酶活性增强在棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性中起主要作用。NADPH-细胞色素P450还原酶(EC 1.6.2.4, NADPH-cytochrome P450 reductase,简称CPR)是细胞色素P450氧化还原酶系的重要组成部分,在细胞色素P450介导的氧化还原反应中起限速作用。本文采用RACE策略得到了棉铃虫CPR基因(Ha_CPR)的全长cDNA序列,研究了这个基因在棉铃虫体内的时空表达,并分别通过喂食和注射dsRNA两种方法干扰Ha_CPR基因的表达,观察Ha_CPR基因沉默后棉铃虫对杀虫剂的毒力、解毒代谢酶活力和生长发育的影响,以期为深入研究细胞色素P450酶系在棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性形成及棉铃虫的生长发育过程中的作用提供一定的理论基础。1.棉铃虫Ha_CPR基因的克隆与分析采用RT-PCR和RACE策略克隆出棉铃虫CPR基因Ha_CPR的全长cDNA序列(GenBank登录号为：HQ116527)。Ha_CPR基因的全长cDNA序列大小为2232bp,开放阅读框为2061bp,编码687个氨基酸,具有CPR蛋白的典型结构域,如FMN结合域、FMN连接域、FAD和NADPH结合域,保守氨基酸残基如Y149、Y187、Y467、Y489和W686。获得的棉铃虫CPR基因Ha_CPR与甘蓝夜蛾的CPR基因的相似性最高,为96%,与其它昆虫CPR的相似性为70%-89%。2.棉铃虫Ha_CPR基因的时空表达采用实时荧光定量PCR方法,比较了Ha_CPR基因在棉铃虫不同发育阶段及不同组织部位的表达情况。结果表明Ha_CPR基因在棉铃虫整个发育阶段及不同组织部位均有表达,卵期至幼虫期表达量逐渐升高,在3-4龄期达到最高,随后下降,蛹期降至最低,羽化后表达量再次升高。各时期的表达量分别为5龄期表达量的0.59(卵期)、1.46(1～2龄期)、1.54(3～4龄期)、0.26/0.19(雌蛹/雄蛹)和1.21/1.29(雌虫/雄虫)倍；Ha_CPR基因在棉铃虫5龄幼虫不同组织的表达分析结果表明,中肠部位表达量最高,脂肪体次之,头部最低,其表达量依次是整体表达量的3.61、1.29和1.08倍。3.棉铃虫Ha_CPR基因沉默后对杀虫剂毒力及代谢酶活力的影响通过喂食或注射的方式将Ha_CPR基因的dsRNA导入棉铃虫3龄或5龄幼虫体内,研究该基因沉默后对杀虫剂毒力及棉铃虫代谢酶活力的影响。敏感品系SCD、拟除虫菊酯抗性品系XJ和AY-R的3龄幼虫在喂食dsRNA(0.8μg/μl×2.5μ1)后,Ha_CPR基因的mRNA相对表达量与对照相比分别下降了49%(57%)、26%和23%。生物测定结果表明氰戊菊酯、溴氰菊酯和久效磷对三个品系处理组的毒力均有不同程度的下降,处理组与对照组间LC50比值为0.34～0.80,但在XJ和AY-R品系中,氰戊菊酯对处理组LC50的95%置信区间与对照组重叠。三种药剂单浓度下的死亡率T-test分析结果表明：(1)SCD品系,氰戊菊酯浓度为0.01mg/ml和0.02mg/ml时,处理组与对照组间的死亡率存在极显著差异；溴氰菊酯浓度为0.0025mg/ml时存在极显著差异。(2)XJ品系,氰戊菊酯浓度为0.08mg/m1时,处理组与对照组间的死亡率存在显著差异。(3)AY-R品系,氰戊菊酯浓度为25.6 mg/m1时,处理组与对照组间的死亡率存在显著差异。研究结果表明Ha_CPR基因的沉默能够在一定程度上增强棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性,而对久效磷类杀虫剂则无影响。AY-R品系1日龄5龄幼虫在注射dsRNA(14μg,10μl)进行基因沉默后,Ha_CPR基因在中肠和脂肪体中的mRNA相对表达量与注射缓冲液(10μ1)的对照组相比分别下降了12%和25%。酶活力测定结果表明处理组与对照组间的多功能氧化酶、谷胱甘肽-S-转移酶以及羧酸酯酶活力均无显著差异。4.Ha CPR基因沉默后对棉铃虫生长发育的影响通过喂食方式将Ha_CPR dsRNA导入SCD品系棉铃虫3龄幼虫体内,研究了Ha_CPR基因沉默后对棉铃虫生长发育的影响。SCD品系3龄幼虫在喂食dsRNA(0.8μg/μl×2.5μl)进行基因沉默后,Ha_CPR基因的mRNA相对表达量与对照组相比下降了49%。在基因沉默后幼虫的整个发育过程中,处理组与对照组的3龄和4龄幼虫历期无显著差异,但在5龄幼虫期和预蛹期存在极显著差异,即处理组历期明显长于对照组；处理组幼虫体重在基因沉默后的第1、3和7天显著高于对照组；化蛹过程中,处理组与对照组间的蛹重和化蛹率均无显著差异；羽化过程中,处理组比对照组推迟一天羽化,但两组间的羽化率和残翅率均无显著差异；在整个发育历期中,处理组与对照组试虫的死亡率均呈上升趋势,但无显著差异。研究结果表明Ha_CPR基因对棉铃虫生长发育有一定程度延缓发育的作用,但在整个发育过程中并不起到主要作用。

全文目录


摘要  7-10ABSTRACT  10-13缩略语  13-14第一章 文献综述  14-28  1 细胞色素P450酶系  14-22    1.1 细胞色素P450  15-16    1.2 NADPH-细胞色素P450还原酶  16-22      1.2.1 CPR的发现  16      1.2.2 CPR的结构  16-19      1.2.3 CPR的功能  19-20      1.2.4 CPR家族  20-22  2 RNA干扰技术在基因功能研究中的应用  22-24    2.1 RNA干扰技术作用原理及作用方式  22-23    2.2 RNA干扰技术的应用  23-24  3 异源表达系统在P450基因功能研究中的应用  24-26  4 本实验研究的目的和意义  26-28第二章 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰  28-66  1 材料与方法  29-39    1.1 供试昆虫  29    1.2 主要试剂  29    1.3 总RNA的提取及检测  29-30      1.3.1 总RNA的提取  29-30      1.3.2 总RNA检测  30    1.4 第一条cDNA链的合成  30    1.5 棉铃虫CPR基因cDNA片段扩增、克隆与测序  30-31      1.5.1 引物设计及cDNA片段扩增  30-31      1.5.2 产物纯化、克隆和测序  31    1.6 CPR基因全长cDNA克隆  31    1.7 序列分析及系统发育树的构建  31-32    1.8 CPR基因在棉铃虫不同发育阶段及不同组织部位的表达分析  32-33      1.8.1 实时荧光定量PCR反应  32      1.8.2 实时荧光定量PCR反应扩增效率的测定  32      1.8.3 CPR基因mRNA表达量比较  32-33    1.9 RNAi介导的基因沉默对棉铃虫解毒代谢能力及生长发育的影响  33-39      1.9.1 棉铃虫CPR基因特异性片段的克隆及dsRNA合成  33-36      1.9.2 dsRNA喂食及注射剂量的确定  36      1.9.3 dsRNA干扰时效的确定  36      1.9.4 生物测定  36      1.9.5 代谢酶活力测定  36-38      1.9.6 生长发育情况观察  38      1.9.7 RNA干扰效率检测  38-39  2 结果与分析  39-62    2.1 棉铃虫CPR基因cDNA片段克隆与序列分析  39    2.2 棉铃虫CPR基因Ha_CPR全长cDNA的克隆与序列分析  39-45      2.2.1 Ha_CPR基因全长cDNA的克隆  39-40      2.2.2 Ha_CPR基因的系统进化分析  40-45    2.3 PCR产物熔解曲线和实时荧光定量PCR扩增效率一致性分析  45-46    2.4 Ha_CPR基因在棉铃虫不同发育阶段及不同组织部位的表达分析  46-47    2.5 RNAi介导的Ha_CPR基因沉默对棉铃虫解毒代谢能力及生长发育的影响  47-62      2.5.1 dsRNA喂食及注射剂量的确定  47-49      2.5.2 dsRNA干扰时效的确定  49      2.5.3 Ha_CPR基因沉默对拟除虫菊酯类杀虫剂毒力的影响  49-56      2.5.4 Ha_CPR基因沉默对棉铃虫酶活性的影响  56-58      2.5.5 Ha_CPR基因沉默对棉铃虫生长发育的影响  58-62  3 讨论  62-66    3.1 NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)的结构与功能  62    3.2 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)的表达情况  62-63    3.3 NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)与昆虫代谢抗性  63-65    3.4 NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)与昆虫生长发育  65-66全文总结与展望  66-68参考文献  68-78附录  78-86  1 材料与方法  79-82    1.1 实验菌株、质粒及培养基  79-80      1.1.1 菌株  79      1.1.2 质粒  79      1.1.3 培养基  79-80    1.2 主要试剂  80    1.3 表达载体的构建  80    1.4 棉铃虫P450基因CYP6AE14、CYP6B7和CYP9A12在酵母中的表达  80-81      1.4.1 转化酵母细胞  80-81      1.4.2 半乳糖诱导的外源基因表达  81    1.5 酵母细胞反应粗酶液的提取  81    1.6 重组酵母细胞多功能氧化酶活性测定  81-82    1.7 重组酵母细胞蛋白浓度标定  82  2 结果与分析  82-83    2.1 棉铃虫P450基因CYP6AE14、CYP6B7和CYP9A12在酵母中的表达  82    2.2 重组酵母细胞多功能氧化酶活性测定  82-83  3 讨论  83-86    3.1 酵母表达系统  83    3.2 细胞色素P450在昆虫解毒代谢中的作用  83-86致谢  86

相似论文

  1. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  2. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  3. Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
  4. 棉铃虫和烟夜蛾生殖生物学特性比较研究,S433
  5. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  6. 甜菜夜蛾信息素结合蛋白的表达动态及其受交配和钟基因沉默的影响,S433.4
  7. 硅、硫对水稻砷吸收、积累的影响机制研究,S511
  8. 多菌灵降解菌的分离鉴定、生物学特性及多菌灵水解酶基因的克隆和表达研究,X172
  9. 烟草中NAC类转录因子基因的克隆与分析,Q943.2
  10. 氰氟草酯降解菌分离鉴定、降解特性的研究及氰氟草酯水解酶基因（chbH）的克隆和表达,X172
  11. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  12. 红曲霉洛伐他汀生物合成相关基因克隆与分析,TQ927
  13. 产酶溶杆菌OH11菌株胞外酶调控相关基因ctp的克隆及功能分析,TQ925
  14. α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究,TQ925
  15. 马铃薯甲虫脯氨酸脱氢酶基因的克隆、表达分析及其dsRNA的发酵生产,S435.32
  16. 棉铃虫Cry1Ac抗性相关钙粘蛋白基因缺失突变的适合度代价,S435.622.3
  17. 棉铃虫和烟夜蛾在4个辣椒品种上的寄主适合度差异研究,S436.418
  18. 荧光假单胞菌7-14生物膜突变株的筛选及tatC基因的克隆与功能初析,S432.4
  19. 烟夜蛾气味受体基因和精氨酸激酶基因的克隆与表达分析,S433.4
  20. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3

中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 纤维作物病虫害 > 棉病虫害 > 虫害 > 棉红铃虫
© 2012 www.xueweilunwen.com