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鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析

作　者: 叶焕春
导　师: 李银；李祥瑞
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性支气管炎病毒分离鉴定 S1基因 N基因序列分析原核表达
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由冠状病毒科、冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。此病在世界各地均有发生,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。IBV是单股RNA病毒,该病毒基因可由于点突变和重组而发生变异,因此IBV的血清型较多,已达30余种之多。不同血清型毒株之间仅有部分或无交叉保护作用,从而给本病的防治带来困难。我国目前虽然已广泛使用IB疫苗,但由于IBV的易变异型,IB仍然呈高度流行趋势,尤其是在已免疫鸡群中也常常爆发IB,造成严重的经济损失。因此,对IB的发生、流行和病原变异的分析和研究,将为该病的综合防控提供有用的参考依据。本研究对江苏地区疑似鸡传染性支气管炎的病料进行了实验室病毒分离和鉴定。结果表明,四株分离株均能引起胚体发育不良,个体小,头、爪合抱,呈蜷缩现象；其尿囊液不能凝集鸡红细胞,但经2%胰酶处理后能凝集鸡红细胞；在鸡胚内对NDV LaSota株有干扰作用；动物回归试验复制出的病例表现出的临床症状、病理变化与自然发病的病例相同。所以可初步断定所分离的四株病毒为鸡传染性支气管炎病毒。应用RT-PCR方法扩增出四株IBV分离株的S1基因和N基因,将其进行了克隆、序列测定及分析。构建了系统进化树,分析了四株IBV分离株与参考毒株之间的系统进化关系。四株IBV分离株S1基因的长度分别由1611、1611、1650、1641个核苷酸组成,分别编码537、537、550、547个氨基酸。四株分离株之间S1基因核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分别为80.0%～97.4%、82.9%～95.9%。分离株JS3、JS4与其它参考毒株同源性较低,在72.9%～81.8%之间,基因序列内有大量的碱基突变、插入和缺失。系统进化树分析表明,分离株JS1、JS2与呼吸型毒株归属于一个分支,分离株JS3、JS4与国内分离的肾型毒株归于一个分支。四株分离株的S蛋白裂解位点均为RRFRR,与标准呼吸型毒株裂解位点一致。四株IBV分离株N基因的长度均为1230bp,编码409个氨基酸。四株分离株之间N基因核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分别为86.7%～96.1%、88.0%～98.3%。N基因系统进化树也显示分离株JS1、JS2与JS3、JS4位于两个分支。N基因序列内没有碱基的插入与缺失,但是大量的点突变造成氨基酸的替代,氨基酸的替代也出现在N蛋白的三个保守碱性氨基酸区内。以上分析结果表明,本实验分离的IBV分离株存在较为广泛的基因突变、插入和缺失,同时,IBV毒株间的基因重组也可能是IBV变异株产生的另一主要原因。本实验中分离株JS1、JS2属于呼吸型毒株；分离株JS3、JS4属于肾型毒株。本研究将IBV N基因定向插入原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-N,并转化至表达菌BL21 (DE3),通过IPTG的诱导表达,将表达蛋白进行SDS-PAGE检测,重组质粒得到高效表达。Western blot分析显示,N基因表达产物能够与IBV多抗血清IgG反应,具有较好的抗原性。

全文目录

摘要 5-7ABSTRACT 7-9英文缩略表 9-11第一篇文献综述 11-39 第一章鸡传染性支气管炎的研究进展 11-39 1. 鸡传染性支气管炎概述 11-13 2. IB病原学研究进展 13-17 3. IBV的分子生物学研究进展 17-26 4. IB疫苗的研究进展 26-31 参考文献 31-39第二篇实验部分 39-83 第二章四株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定 39-49 1. 材料与方法 40-42 2. 结果 42-44 3. 讨论 44-46 参考文献 46-49 第三章四株IBV分离株S1、N基因的克隆和序列分析 49-73 1. 材料与方法 50-56 2. 结果 56-65 3. 讨论 65-69 参考文献 69-73 第四章鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的原核表达 73-83 1. 材料与方法 73-77 2. 结果 77-79 3. 讨论 79-81 参考文献 81-83全文总结 83-85附录:常用试剂的配制 85-87致谢 87

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