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羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定

作　者: 吕玉金
导　师: 李文刚；吴清民
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 布鲁氏菌 外膜蛋白 原核表达 诊断性蛋白 免疫保护力
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


布鲁氏菌病是由胞内寄生革兰氏阴性菌--布鲁氏菌引起的一种人畜共患病。作为一种重要的人畜共患病,布鲁氏菌病给人类健康和畜牧业的发展带来了巨大危害。长期以来,因为现有疫苗缺乏诊断标记以及尚未开发出有效的鉴别诊断抗原,导致疫苗免疫动物和临床患病动物难以鉴别,使患病动物在自然群体中长期存在,阻碍动物布鲁氏菌病的根除和净化。所以迫切需要加强安全、有效、可鉴别疫苗的研究以及对现有检测诊断技术的改进。在国内外研究的基础上,从16M膜蛋白中选取9个蛋白,分别为OMP31、BP26、L7/L12、BCSP31、Dnak、cuznSOD、GroEL、GroES和P39。利用PCR扩增方法获得目的基因,用凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段。将限制性内切酶NdeI、XhoI双酶切后的目的片段与同样双酶切的表达载体连接,转化DH5a感受态细胞,并通过PCR扩增、酶切鉴定和序列测定鉴定重组质粒,结果表明9个重组表达质粒成功构建,且重组质粒中携带的目的基因编码框完全正确。成功转化Rosetta感受态细胞,获得9个转化菌株,然后摸索含有重组质粒的表达菌株在不同收菌时间、不同IPTG浓度诱导下目的蛋白表达情况,SDS-PAGE电泳检测结果显示目的蛋白在大肠杆菌中获得了大量表达。用临床牛布鲁氏菌阳性血清进行Western-blot分析,9种表达蛋白均发生了阳性反应。对表达产物用Ni螯合亲和层析法进行纯化,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,用临床牛布鲁氏菌阳性血清为一抗,用HRP标记的羊抗牛IgG为二抗,最后建立了以BP26蛋白为抗原检测布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,阳性血清检出率为96%,验证了该蛋白良好的免疫原性以及作为诊断抗原的潜力。将纯化的His-OMP31、His-BP26、His-L7/L12、His-BCSP31、His-Dnak、His-cuznSOD、His-GroEL、His-GroES、His-P39蛋白与佐剂乳化后背部皮下免疫小鼠,初免使用完全弗氏佐剂,再免使用不完全弗氏佐剂。结果证明上述重组蛋白均能产生一定程度的免疫保护力,其中OMP31、BP26、GroEL、GroEs、P39蛋白免疫保护效果较好,该结果为布鲁氏菌亚单位疫苗或DNA疫苗的研究开发奠定了一定的基础。

全文目录


致谢  5-9摘要  9-10英文缩写词表  10-11文献综述  11-18  1 布鲁氏菌病概述  11-12  2 布鲁氏菌的流行状况  12  3 布鲁氏菌病的防制措施  12-13  4 布鲁氏菌病的诊断现状  13-14  5 布鲁氏菌的免疫方面  14-15  6 布鲁氏菌外膜蛋白的研究进展  15-17  7 本研究的目的意义  17-18第一部分 布鲁氏菌部分菌体蛋白重组表达质粒的构建及诱导表达  18-43  1.1 材料  18-22    1.1.1 主要试剂  18    1.1.2 菌株和菌种  18    1.1.3 质粒  18-20    1.1.4 引物合成  20    1.1.5 试验所用试剂及配制  20    1.1.6 所需的基本溶液  20    1.1.7 DNA 提取所用溶液  20-21    1.1.8 肠杆菌感受态细胞的制备及转化所用溶液  21    1.1.9 琼脂糖凝胶电泳所用溶液  21    1.1.10 制备重组外膜蛋白相关试剂及其配制  21    1.1.11 SDS-PAGE 试剂的配制  21-22  1.2 重组质粒的构建  22-23    1.2.1 布鲁氏菌16M 基因组的提取  22    1.2.2 PCR 引物的设计与合成  22    1.2.3 降落PCR 扩增目的基因  22-23    1.2.4 PCR 产物的回收纯化  23    1.2.5 目的片段的双酶切  23    1.2.6 表达载体pET-21b 和PET-32a 的双酶切  23    1.2.7 连接  23    1.2.8 转化  23  1.3 重组质粒的鉴定  23-24    1.3.1 PCR 鉴定  23-24    1.3.2 双酶切鉴定  24    1.3.3 测序  24  1.4 重组表达质粒的诱导表达与条件优化  24-25    1.4.1 诱导表达  24    1.4.2 蛋白表达条件的优化  24-25  1.5 结果  25-40    1.5.1 目的基因的获得  25-26    1.5.2 重组质粒的双酶切鉴定  26-29    1.5.3 测序结果与序列分析  29-36    1.5.4 重组表达质粒的表达  36-37    1.5.5 蛋白表达条件的优化  37-40  1.6 讨论  40-42    1.6.1 关于蛋白的表达  41-42  小结  42-43第二部分 重组蛋白的纯化与抗原性鉴定  43-56  2.1 材料  43-45    2.1.1 蛋白纯化用溶液及其配制  43    2.1.2 Western-blot 用溶液及其配制  43    2.1.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）相关溶液  43-44    2.1.4 主要仪器和设备  44-45  2.2 方法  45-46    2.2.1 Western-blot 鉴定  45    2.2.2 蛋白的纯化  45-46    2.2.3 利用重组蛋白检测阳性布鲁氏菌抗体间接ELISA 方法的建立  46  2.3 结果  46-53    2.3.1 Western-blot  46-49    2.3.2 目的蛋白的纯化：亲和层析方法  49-50    2.3.3 BP26-ELISA 检测布鲁氏菌抗体方法的建立  50-53  2.4 讨论  53-55  小结  55-56第三部分 重组蛋白的免疫保护力研究  56-60  3.1 材料  56    3.1.1 试剂  56    3.1.2 动物  56  3.2 方法  56    3.2.1 动物分组与免疫  56    3.2.2 免疫保护评价  56  3.3 结果  56-57  3.4 讨论  57-59  小结  59-60结论  60-61参考文献  61-69ABSTRACT  69-70

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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