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草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究

作　者: 熊玲芳
导　师: 吴灶和；简纪常
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: GCRV096 vp6 ns38 克隆 原核表达 免疫原性
分类号: S941.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 22次
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内容摘要


草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV) ,属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属,其基因组的特点是11条分段dsRNA的3′端不含poly(A)尾,且在5′和3′末端各含有特异的重复保守序列。GCRV的基因组编码12种蛋白,包含7种结构蛋白和5种非结构蛋白。其中VP6是一种结构蛋白,它由S8基因片段编码,在病毒的转录与复制及病毒核衣壳的形成中起重要作用。NS38是一种非结构蛋白,它由S9片段编码,在病毒早期形态发生阶段起重要作用。有研究表明VP6诱导中和抗体效价较高,NS38诱导的中和抗体效价次之,二者都能够诱导中和抗体的产生。本研究以草鱼呼肠孤病毒096(GCRV096)为研究对象,应用同源克隆获得GCRV096 vp6和ns38基因序列,并对其进行表达,同时对VP6和NS38蛋白的免疫原性进行研究。vp6基因含有一个1236 bp的开放阅读框(ORF),编码412个氨基酸,预测VP6蛋白分子量约为44 kDa,等电点为8.5。与其它几种GCRV病毒分离株相比,核苷酸序列的同源性要高于其氨基酸序列的同源性。将vp6基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-vp6,然后导入到大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,纯化表达的目的蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫兔子,制备多克隆抗体,得到兔抗GCRV096-VP6蛋白血清。通过ELISA检测,兔抗GCRV096-VP6蛋白血清的效价为1:32000。将制备的抗血清与CIK细胞孵育48 h,然后对CIK细胞进行病毒感染,应用定量PCR对CIK细胞中GCRV096 vp6基因的表达进行定量,进而分析VP6蛋白的免疫原性,实验结果表明实验组的GCRV病毒含量明显少于对照组,说明VP6蛋白具有较强的免疫原性。ns38基因含有1059 bp的ORF,编码352个氨基酸,预测NS38蛋白分子量约为37.7 kDa,等电点为7.5。与其它几种GCRV病毒分离株相比,核苷酸序列的同源性要高于其氨基酸序列的同源性。将ns38基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-ns38,再导入到大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,进而纯化表达的目的蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫兔子,制备多克隆抗体,得到兔抗GCRV096-NS38蛋白血清。通过ELISA检测,兔抗GCRV096-NS38蛋白血清的效价为1:38400。将制备的抗血清与CIK细胞孵育48 h,然后对CIK细胞进行病毒感染,应用定量PCR对CIK细胞中GCRV096 ns38基因的表达进行定量,进而分析NS38蛋白的免疫原性;实验结果表明实验组的GCRV病毒含量明显少于对照组,说明NS38蛋白具有较强的免疫原性,而且在感染GCRV病毒4 h时,实验组病毒的含量与对照组之比最小,表明此时NS38蛋白发挥免疫原作用较强。本论文研究了GCRV096 vp6和ns38基因和VP6和NS38蛋白特性,并对VP6和NS38蛋白的免疫原性进行了研究,为草鱼出血病的防治等研究提供了理论依据并奠定了基础。

全文目录


摘要  6-8Abstract  8-131 前言  13-20  1.1 草鱼出血病的研究进展  13  1.2 GCRV 的结构与特征  13-16    1.2.1 形态结构  13-14    1.2.2 理化特性  14    1.2.3 分子生物学特征  14-15    1.2.4 培养特性  15    1.2.5 GCRV 的组织嗜性和病理变化  15-16    1.2.6 GCRV 多肽的免疫原性研究  16    1.2.7 病毒的检测  16  1.3 草鱼出血病的防治方法  16-18    1.3.1 疫苗的研究  16    1.3.2 免疫增强剂的研究  16-17    1.3.3 环境对草鱼出血病的免疫防治研究  17    1.3.4 其他防治方法的研究  17-18  1.4 研究的技术路线  18-19  1.5 本文研究的目的意义  19-202 GCRV096 vp6 基因的克隆、表达及VP6 蛋白免疫原性研究  20-48  2.1 引言  20  2.2 材料  20-26    2.2.1 病毒株和细胞系  20    2.2.2 质粒载体和受体菌株  20-21    2.2.3 主要试剂  21-25    2.2.4 主要仪器  25-26  2.3 方法  26-36    2.3.1 vp6 基因克隆的方法  26-29    2.3.2 vp6 基因原核表达的方法  29-33    2.3.3 重组蛋白VP6 多克隆抗体制备的方法  33-34    2.3.4 VP6 蛋白免疫原性研究的方法  34-36  2.4 结果  36-46    2.4.1 vp6 基因的克隆  36-39    2.4.2 vp6 基因的原核表达  39-44    2.4.3 重组蛋白VP6 多克隆抗体效价的测定  44    2.4.4 VP6 蛋白免疫原性研究  44-46  2.5 讨论  46-483 GCRV096 ns38 基因的克隆、表达及其NS38 免疫原性研究  48-65  3.1 引言  48  3.2 材料  48-49    3.2.1 病毒株和细胞系  48    3.2.2 质粒载体和受体菌株  48    3.2.3 主要试剂  48-49    3.2.4 主要仪器  49  3.3 方法  49-53    3.3.1 ns38 基因克隆的方法  49-50    3.3.2 ns38 基因原核表达的方法  50-52    3.3.3 重组蛋白NS38 多克隆抗体制备的方法  52    3.3.4 NS38 蛋白免疫原性研究的方法  52-53  3.4 结果  53-63    3.4.1 ns38 基因的克隆  53-55    3.4.2 ns38 基因的原核表达  55-61    3.4.3 重组蛋白NS38 多克隆抗体效价的测定  61-62    3.4.4 NS38 蛋白免疫原性研究  62-63  3.5 讨论  63-654 结论  65-66参考文献  66-73致谢  73-74作者简历  74-75导师简介  75

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学 > 微生物性鱼病 > 病毒性鱼病
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