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小鼠排卵前卵泡闭锁过程中FSH对FOXO1基因的表达调控

作　者: 滕云
导　师: 刘红林；陈杰
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 卵泡闭锁 FSH FOXO1 ERalpha 细胞凋亡
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


在哺乳动物整个卵巢的发育和功能发挥中,卵泡闭锁是一个非常精密且周期性进行的过程,闭锁可以破坏和消除卵巢中的卵泡和卵母细胞。卵泡闭锁是一个很普遍的生理过程,人类在从胎儿到绝经期的发育过程中估计有99.9%的卵母细胞因闭锁而被损失掉。当卵泡发育至排卵前卵泡,若没有排卵则发生闭锁。一般认为出生后的卵泡闭锁是由于卵泡中的颗粒细胞凋亡引起的,但对于排卵前卵泡的闭锁机制目前研究的还不是很清楚。本实验通过对小鼠进行激素处理,使小鼠卵巢中的多数卵泡能够在相同的时期同步发育至排卵前卵泡的阶段。由于卵泡排卵需要黄体生成素(LH)的刺激,因此在未使用LH进行刺激的情况下发育至排卵前卵泡阶段的这些卵泡变发生了闭锁,从而成功的构建了大卵泡闭锁的模型。通过定量PCR、石蜡切片、凋亡染色、蛋白质印迹、染色质免疫沉淀和荧光染色等技术,本实验研究了在大卵泡闭锁过程中FSH对卵泡闭锁的影响以及FSH对颗粒细胞中一些重要调节因子的作用,实验结果表明：1)通过对在闭锁过程中不同时期所取得的卵巢切片进行TUNEL染色,结果表明随着闭锁时间的延长,卵泡中颗粒细胞的凋亡也越来越严重。在卵泡闭锁的过程中若对小鼠进行FSH刺激则可抑制闭锁卵泡中颗粒细胞的凋亡,从实验结果中我们还可以看出排卵前卵泡的闭锁属于腔部闭锁类型,卵泡中的颗粒细胞是从最接近卵泡腔部分开始发生凋亡的。2)运用RT-PCR技术,本研究对闭锁卵泡颗粒细胞中Caspase家族成员的表达变化进行了研究,实验结果表明在卵泡闭锁和FSH对闭锁卵泡的挽救过程中Caspase-8的表达没有明显的变化而Caspase-9和Caspase-3则随卵泡状态的不同表现出不同的表达水平。根据结果我们推测颗粒细胞的凋亡可能是由线粒体凋亡通路所介导的。3)通过RT-PCR比较了在闭锁卵泡和健康卵泡中FoxO1基因的表达水平,结果表明在闭锁的卵泡中FoxO1的表达要高于在健康卵泡中。根据结果还可以看出FSH对闭锁卵泡中FoxO1的表达有明显的抑制作用。FoxO1蛋白表现出与mRNA相同的变化规律。4)对体外培养的颗粒细胞进行FSH刺激可以促使位于胞核中的ERalpha向胞质中转移。通过染色质免疫沉淀技术可以看出在闭锁卵泡颗粒细胞中ERalpha在FoxO1基因启动子区有较多的募集,而在FSH挽救颗粒细胞凋亡的过程中FSH可以抑制ERalpha蛋白在FoxO1基因上的聚集作用。因此,排卵前卵泡发生闭锁的部分原因有可能是卵泡颗粒细胞中FoxOl基因表达量的升高以及翻译后蛋白量的增加,而FSH对闭锁卵泡的挽救作用有可能是通过对颗粒细胞中雌激素受体ERalpha的表达和功能进行调节从而对细胞中FoxO1勺变化产生影响。本研究对卵泡闭锁机制的探索具有一定的参考意义。

全文目录


目录  4-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一篇 文献综述  10-44
  第一章 卵泡发生与闭锁研究概况  10-34
    1 卵泡发育与闭锁简介  10-21
      1.1 卵泡  10-12
      1.2 卵泡生长  12-15
      1.3 卵泡闭锁  15-21
    2 卵泡闭锁的研究进展  21-23
      2.1 细胞骨架对卵泡闭锁的影响  21-22
      2.2 氧化应激对卵泡闭锁的影响  22-23
      2.3 免疫细胞及免疫调节因子对卵泡闭锁的影响  23
    3 卵泡闭锁的研究意义  23-26
    参考文献  26-34
  第二章 FSH及其对卵泡闭锁的影响  34-38
    1 FSH的结构  34
    2 FSH的基因定位  34
    3 FSH的生物功能  34-36
    参考文献  36-38
  第三章 FOXO1及其对卵泡闭锁的影响  38-44
    1 FOXO1的蛋白结构  38-39
    2 FOXO1的基因定位  39
    3 FOXO1的生理功能  39-42
    参考文献  42-44
第二篇 试验部分  44-86
  第一章 排卵前卵泡闭锁模型的建立  44-64
    1 材料和方法  44-53
      1.1 实验材料  44-46
      1.2 实验方法  46-53
      1.3 数据分析  53
    2 试验结果  53-57
      2.1 TUNEL染色  53-54
      2.2 定量PCR  54-57
    3 讨论  57-62
    参考文献  62-64
  第二章 卵泡闭锁过程中FSH对FOXO1的表达调控  64-86
    1 材料和方法  64-72
      1.1 实验材料  64-66
      1.2 实验方法  66-72
    2 实验结果  72-84
      2.2 WB  73-74
      2.3 上游转录因子预测  74
      2.4 转录因子筛选  74-78
      2.5 免疫荧光  78
      2.6 CHIP  78-80
      2.7 讨论  80-84
    参考文献  84-86
全文结论  86-88
致谢  88

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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