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猪卵泡闭锁过程中部分相关基因表达特征研究

作　者: 付衍辉
导　师: 刘红林
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪基因表达卵泡闭锁
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

哺乳动物卵泡在发育过程中伴随着大量卵泡闭锁(atresia),卵泡闭锁是一个多种因子参与的复杂调控过程,相关的研究已经证实了某些因子的调控作用,但卵泡闭锁的机制有待于进一步研究,对于卵泡闭锁机制的进一步研究,有助于提高动物的繁殖率及阐明排卵障碍有关疾病的机理。本实验采用直径为3-5mm的猪卵泡为研究对象,通过卵泡形态和卵泡液中雌二醇与孕酮含量的比例确定卵泡闭锁程度。在对卵泡闭锁程度准确分类的基础上,检测了卵泡闭锁相关基因在猪卵泡闭锁过程中表达量的变化,重点研究了猪卵泡闭锁过程中线粒体凋亡途径重要基因的表达特征；并分析了这些基因表达量间及与卵泡各生理指标间的相关性。猪卵泡闭锁程度的判定方法：采用外观形态观察和孕激素/雌激素比例两方面标准综合判定卵泡闭锁程度,将供试卵泡分为健康、早期闭锁和晚期闭锁三个类型。判断标准包括：1)外观形态判断标准：健康卵泡的外观呈现清澈透明,颗粒细胞层完整,卵丘卵母细胞复合体清晰可见；早期闭锁的卵泡外观呈现浑浊的橘黄色,颗粒细胞层有破损,卵丘卵母细胞复合体不易辨认；晚期闭锁的卵泡外观呈现浑浊的灰色,颗粒细胞层及卵丘卵母细胞复合体严重脱落；2)孕激素/雌激素比例标准：健康卵泡P4/E2<5；早期闭锁卵泡5<P4/E2<10；晚期闭锁卵泡P4/E2>10。本实验检测了卵泡闭锁相关基因mRNA表达的变化：在健康、早期闭锁和晚期闭锁卵泡中各取10个卵泡,按单个卵泡分别提取RNA,利用qRT-PCR技术分别对VEGFA、Cx43、Egr-1、CYPIAl、FasL、Foxol、Caspase-3、IL-1β、P53、Bcl-XL Mcl-1、Bcl-2、Bax、Bak、Bid和Bim共16个基因在单个卵泡中的mRNA丰度进行测定。结果发现：VEGFA基因在健康的卵泡中表达量最高,随着卵泡闭锁程度的加深,表达量逐步降低,健康卵泡中VEGFA基因的表达量极显著高于晚期闭锁的卵泡,早期闭锁卵泡中VEGFA基因表达量显著高于晚期闭锁的卵泡；Cx43、Egr-1和IL-1β基因在晚期闭锁卵泡中表达量最高,随着卵泡闭锁程度的加深,表达量逐步升高。在早期和晚期闭锁卵泡中Cx43及IL-1β基因表达量极显著高于健康的卵泡,Egr-1基因表达量在早期闭锁和晚期闭锁卵泡中显著高于健康卵泡；CYPIAl、FasL、Foxol、Caspase-3和P53基因表达量在闭锁卵泡中最高,随着卵泡闭锁程度的加深,表达量逐步升高。早期闭锁和晚期闭锁的卵泡中FasL及P53基因表达量极显著高于健康卵泡组,早期闭锁和晚期闭锁的卵泡中CYP1A1基因表达量显著高于健康组卵,闭锁卵泡中Foxo1基因表达量极显著高于健康组卵泡,早期闭锁卵泡中Foxol基因表达量显著高于健康组卵泡,闭锁卵泡中Caspase-3基因表达量极显著高于健康和早期闭锁组的卵泡；Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、Bak、Bax、Bid和Bim基因表达量在闭锁卵泡中最高,随着卵泡闭锁程度的加深,表达量逐步升高。早期闭锁和晚期闭锁的卵泡中Bcl-2、Mcl-1、Bid及Bim基因表达量极显著高于健康卵泡组,晚期闭锁的卵泡中Bcl-XL及Bak基因表达量极显著高于健康组和早期闭锁组卵泡,在健康和早期闭锁组卵泡中这两个基因的表达量基没有显著差异；Bax基因的表达量随着卵泡闭锁程度的加深而升高,健康、早期闭锁及晚期闭锁的卵泡中Bax基因表达量没有差异。本研究还分析了卵泡各基因表达量与P/E比值的相关性。VEGFA基因表达量与卵泡液P/E比值的相关系数为-0.349,无显著的相关性；Cx43基因表达量与P/E比值的相关系数为0.510,呈极显著的正相关；Egr-1基因表达量与P/E比值的相关系数为0.301,无显著的相关性；CYP1A1基因表达量与P/E比值的相关系数为0.295,无显著的相关性；FasL基因表达量与P/E比值的相关系数为0.509,达到极显著的相关性；Foxo1基因表达量与P/E比值的相关系数为0.420,达到极显著的正相关；Caspase-3基因的表达量与P/E比值的相关系数为0.398,达到极显著的正相关；IL-1β基因表达量与P/E比值的相关系数为0.749,达到极显著的正相关；P53基因表达量与P/E比值的相关系数为0.611,达到极显著正相关性；Bcl-2基因表达量与P/E比值的相关系数为0.481,达到极显著的正相关性；Mel-1基因表达量与P/E比值的相关系数为0.546,达到极显著的正相关性；Bcl-XL基因表达量与P/E比值的相关系数为0.559,达到极显著的正相关性；Bak基因表达量与P/E比值的相关系数为0.478,达到极显著的正相关性；Bax基因表达量与P/E比值的相关系数为0.038,无显著的相关性；Bid基因表达量与P/E比值的相关系数为0.619,达到极显著的正相关性；Bim基因表达量与P/E比值的相关系数为0.632,达到极显著的正相关性。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-12第一章文献综述 12-32 1 哺乳动物卵泡发育的基本模式 12-15 1.1 原始卵泡库的建立 12-13 1.2 卵泡的募集 13-14 1.3 优势卵泡的选择与优势化 14 1.4 卵泡的成熟排卵 14 1.5 卵泡闭锁与退化 14-15 2 哺乳动物卵泡发育调控机理研究进展 15-19 2.1 卵泡发育调控基本机理 15-16 2.2 卵泡发育与垂体繁殖激素的关系 16-17 2.3 颗粒细胞与卵泡发育的关系 17-19 3 卵泡闭锁机制研究 19-31 3.1 激素与卵泡闭锁 19-21 3.2 细胞因子对卵泡闭锁的调控 21-25 3.3 卵泡闭锁的相关基因 25-31 3.4 卵泡闭锁的表观遗传学研究 31 4 本实验的研究内容及目的意义 31-32第二章实验部分 32-66 1 实验材料 32-35 1.1 实验动物 32 1.2 试剂和与仪器 32-34 1.3 主要生物学数据库及软件 34-35 1.4 溶液配制 35 2 实验过程 35-41 2.1 卵泡的剥离及泡液的收集 35-36 2.2 卵泡闭锁程度的判断 36 2.3 总RNA的提取及检测 36-38 2.4 普通RT-PCRR与产物检测 38-39 2.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 39-41 2.6 数据分析 41 3 实验结果与分析 41-58 3.1 卵泡样品闭锁程度的综合判定 41-42 3.2 目的基因的RT-PCR扩增结果 42 3.3 Real-Time PCR扩增结果及检测 42-46 3.4 Real-time PCR定量结果分析 46-51 3.5 卵泡中激素水平与相关基因mRNA表达量相关性分析 51-53 3.6 相关基因mRNA表达量间的相关性分析 53-58 4 讨论 58-66 4.1 影响实验成功的因素 58-59 4.2 猪卵泡闭锁程度的分类方法 59-61 4.3 卵泡闭锁相关基因对卵泡闭锁的影响 61-66参考文献 66-80全文结论 80-82附录 82-90攻读硕士学位期间发表的学术论文 90-92致谢 92

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