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研究背景:坏死性小肠结肠炎(Necrotizing enterocolitis,NEC)是新生儿期发病率和病死率均较高的肠道炎症性疾病,主要累及回肠末端和结肠近端,临床上以腹胀、呕吐、便血为主要表现,严重者可出现肠穿孔、腹膜炎、休克、脓毒血症等并发症,腹部X线检查以肠壁囊样积气为特征。迄今其确切的病因和发病机制尚未完全阐明,尚无特效的预防和治疗措施。目前认为,早产、喂养不当、感染、肠粘膜缺氧缺血等是NEC发生的高危因素,NEC是多种因素相互作用的结果。在各种高危因素作用下,肠粘膜上皮通透性增加,肠粘膜屏障受损,细菌产物如脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)等入侵,激活免疫系统,引发炎症的级联反应和局灶性坏死。糖巨肽(Glycomacropeptide, GMP)是乳中κ–酪蛋白经凝乳酶水解后生成的一个多功能的多肽片段。它具有多种生物学作用,如抗感染、调节免疫、抗炎和营养保健等。鉴于此,其在食品、医药和保健品领域受到广泛关注,尤其在婴幼儿食品领域。在乳品领域,目前关于牛乳糖巨肽的研究已有大量的报道,但对于人乳糖巨肽的研究却鲜有报道。另外,鉴于糖巨肽对肠道的特殊作用,它有可能对NEC的预防和治疗提供新的思路。因此,本研究拟:(1)开展人乳中糖巨肽含量的研究,为优化婴幼儿配方奶粉的营养成分提供依据;(2)采用合适的方法建立新生大鼠的NEC模型,并给予糖巨肽干预,观察:①糖巨肽能否减轻NEC新生大鼠的肠道损伤;②糖巨肽对肠组织PAF、TNF-α、IL-1β表达的影响;③糖巨肽对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响。从而为使用糖巨肽防治NEC提供实验依据。目的:1.研究人乳中糖巨肽含量,为优化婴幼儿配方奶粉的营养成分提供参考;2.建立新生大鼠NEC模型,探讨糖巨肽对NEC新生大鼠肠道的保护作用,从而为使用糖巨肽防治NEC提供实验依据。方法:1.选取身体健康、无特殊饮食习惯、生活安定、奶量充足,年龄在25~39岁之间,第一胎足月分娩的产妇30例。分为初乳组和成熟乳组,每组15例,每例采集5ml母乳(前段乳汁)。初乳组采集的时间为产后第2天,成熟乳组采集的时间为产后第42天。采集样本前用酒精棉球消毒乳头及收集者的手,人工挤压法将乳汁直接挤入已灭菌消毒的离心管内并标记。采用凝乳酶在37℃条件下对母乳进行水解,120min后对水解产物进行离心,提取上清液,再采用唾液酸测试盒检测上清液中的唾液酸含量(比色法),并以此代表糖巨肽的含量。另外,选取6种市售品牌配方奶粉(惠氏、多美滋、雀巢、雅培、美赞臣、贝因美)配制成液态标准奶,用同样方法检测其中的糖巨肽含量。2.36只SD新生大鼠随机分为三组:NEC模型组,糖巨肽干预组(NEC+GMP)和正常对照组,每组12只。大鼠出生后第1~3天均为母乳喂养;在第4~6天,正常对照组继续母乳喂养,而NEC模型组和糖巨肽干预组则均需脱离母鼠,置于新生鼠保育箱中开始人工喂养(每4小时1次,NEC模型组用常规代乳品喂养,糖巨肽干预组用糖巨肽强化代乳品喂养),并行缺氧复氧冷刺激(每8小时1次)。每日定时称量乳鼠体重,第6天喂养结束后三组大鼠均置于保育箱中空腹24小时,然后用颈椎脱臼法处死大鼠,取回盲部近段回肠组织进行固定、切片,行病理、TUNEL和电镜检查;同时取回盲部附近肠段制备组织匀浆,采用荧光定量PCR的方法检测PAF mRNA的表达,ELISA方法检测TNF-α和IL-1β的表达。结果:1人乳和配方乳中糖巨肽含量的测定与比较1.1最佳酶解条件是:酶液浓度0.25mg/ml,酶解时间120min;1.2初乳组糖巨肽含量为3486.98±406.70 mg/L,成熟乳组糖巨肽含量为2706.38±344.83 mg/L,两组比较,差异具有统计学意义(P<0.01),前者高于后者;但各组内个体间差异小(CV初乳=0.12,CV成熟乳=0.14);1.3配方奶粉组的平均糖巨肽含量为1271.75±802.42mg/L,低于初乳和成熟乳中的水平,差异均具有统计学意义(P<0.01);各种品牌配方奶粉的平均糖巨肽含量:惠氏金装爱儿乐2854.58 mg/L,多美滋金装金盾贝护1279.08 mg/L,多美滋金装低出生体重1114.77 mg/L,雀巢特别能恩558.19 mg/L,雀巢能恩金盾611.35 mg/L,雀巢力多精655.65 mg/L,雅培金装喜康宝898.90 mg/L,美赞臣安婴儿A+ 940.79 mg/L,贝因美初生婴儿配方(国产)1130.88 mg/L,品牌间差异较大(CV=0.63)。2糖巨肽对NEC新生大鼠的作用2.1各组乳鼠体重均有增长,增长幅度:NEC模型组1.57±0.39g,糖巨肽干预组2.02±0.14g,正常对照组3.53±0.46g,糖巨肽干预组与NEC模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01);2.2病理评分:NEC模型组2.17±0.83,糖巨肽干预组0.92±0.79,正常对照组0.17±0.39,糖巨肽干预组与NEC模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。2.3肠组织PAF mRNA表达水平(2-ΔΔCt值):NEC模型组3.01±0.96,糖巨肽干预组1.56±0.29,正常对照组1.01±0.13,糖巨肽干预组与NEC模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。2.4肠组织TNF-α水平:NEC模型组41.94±13.51pg/ml,糖巨肽干预组31.69±11.68pg/ml,正常对照组17.42±7.18pg/ml,糖巨肽干预组与NEC模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2.5肠组织IL-1β水平:NEC模型组150.33±36.41pg/ml,糖巨肽干预组118.36±33.00pg/ml,正常对照组28.44±15.04pg/ml,糖巨肽干预组与NEC模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2.6电镜观察:正常对照组可见其细胞核占细胞体积的大部分,结构清晰,有核膜包被,提示正常细胞相;NEC模型组可见凋亡小体,提示凋亡晚期相;糖巨肽干预组可见染色质靠核膜边集,核孔扩大,提示凋亡早期相。2.7 TUNEL检测肠上皮细胞凋亡率:NEC模型组38.79±9.79,糖巨肽干预组29.54±7.30,正常对照组相6.37±1.96,糖巨肽干预组肠上皮细胞凋亡率低于NEC模型组,两组数据相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.人乳糖巨肽含量较婴幼儿配方奶粉高,初乳糖巨肽含量较成熟乳高;婴幼儿配方奶粉的营养成分有待进一步优化。2.糖巨肽对坏死性小肠结肠炎新生大鼠肠道具有一定的保护作用,其作用机制可能是通过降低PAF、TNF-α和IL-1β的表达,抑制肠粘膜上皮细胞的凋亡,减轻肠组织损伤来实现的。
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