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猪TNF-α单克隆抗体制备与PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞TNF-α变化规律研究

作　者: 朱丽洁
导　师: 姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 肿瘤坏死因子-α 单克隆抗体 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪肺泡巨噬细胞
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)是一种主要由活化单核巨噬细胞和T淋巴细胞产生的多效性细胞因子,与全身性炎症反应有关,参与急性期反应。TNF-α主要作用于免疫细胞的调节,可以诱导细胞凋亡,炎症反应,以及抑制肿瘤和病毒的复制,在疾病感染过程中有重要监测意义。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratiry Syndrone Virus, PRRSV)是引起母猪生殖障碍和仔猪呼吸困难的重要病原之一。根据基因组和抗原性的差异,PRRSV分为欧洲型和美洲型,并存在多种基因亚型,不同分离株毒力差异较大,其致病机制尚不十分清楚。本研究利用原核表达系统获得纯化重组TNF-α蛋白,制备获得其单克隆抗体,并利用实时荧光定量PCR方法和商品化ELISA试剂盒分别检测PAM感染不同毒力PRRSV后TNF-α变化情况,阐明TNF-α在PRRSV感染过程中的作用。1.猪TNF-α原核表达与单克隆抗体制备根据猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因设计两对引物,利用PCR扩增TNF-α成熟蛋白编码基因(534bp),构建原核表达载体PET-28a-TNF-α,并转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,证明TNF-A重组蛋白获得表达。提取纯化该重组蛋白包涵体,免疫BALB/c小鼠,经过3次细胞融合,间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗猪TNF-α单克隆抗体的杂交瘤细胞,将其命名为1E2和2F3。Western blotting结果证明该单克隆抗体能够与重组蛋白发生特异性反应。间接ELISA测定细胞上清抗体效价为分别为1：512,1：1024,腹水效价均为1：128000,单抗1E2为IgG1亚型,轻链为K型,单抗2F3为IgG3亚型,轻链为κ型。杂交瘤细胞连续传代20代,分泌抗体的效价基本一致,从而为进一步建立猪TNF-α的检测方法奠定了基础。2. PRRSV不同毒株感染猪肺泡巨噬细胞TNF-α变化规律比较研究为了研究猪TNF-α在PRRSV感染中的作用,本研究将高致病性PRRSV分离株SY0608和疫苗弱毒株MLV株分别感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),同时,以LPS(脂多糖)刺激的PAM为阳性对照,感染后2、4、6、8、10、12、24h采用实时荧光定量PCR方法检测PRRSV N蛋白mRNA和TNF-αmRNA,并以管家基因β-αctin为内参,对其进行相对定量分析。同时,用猪TNF-αELISA检测试剂盒,检测PAM培养上清中的TNF-α蛋白含量。结果为：PRRSV感染PAM细胞后,N蛋白mRNA水平逐渐升高,MLV毒株感染后病毒增殖速度较快,但SY0608毒株感染后24小时,病毒基因转录水平明显增高。PAM感染高致病性PRRSV和疫苗弱毒株感染后0-10h,TNF-αmRNA水平呈现上升趋势,10h后逐渐下降,TNF-α蛋白含量随着培养时间的延长呈现上升趋势,高致病性PRRSV感染组TNF-α水平明显高于疫苗弱毒株组,表明TNF-α在PRRSV致病机制中起重要作用。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11第一章 肿瘤坏死因子检测技术及其在PRRSV感染中的作用  11-33  1 肿瘤坏死因子  11-12    1.1 肿瘤坏死因子的分子生物学特性  11-12    1.2 肿瘤坏死因子的生物学活性  12  2 肿瘤坏死因子的检测方法  12-17    2.1 生物学检测方法  12-13    2.2 免疫学检测方法  13    2.3 分子生物学检测方法  13-14    2.4 实时荧光定量PCR  14-17      2.4.1 实时荧光定量PCR的技术原理  14-15      2.4.2 实时荧光定量PCR的分类  15-16      2.4.3 实时荧光定量PCR技术的应用  16-17  3 猪肿瘤坏死因子在PRRSV感染中的作用  17-25    3.1 猪繁殖与呼吸综合症  17-21      3.1.1 病毒形态与理化特征  17-18      3.1.2 病毒基因结构  18      3.1.3 PRRSV的致病机理  18-20      3.1.4 高致病性蓝耳病  20-21    3.2 感染蓝耳病病毒后对肺泡巨噬细胞的影响  21    3.3 PRRV感染对细胞因子的影响  21-25      3.3.1 PRRSV抑制IFN-α的产生  22      3.3.2 PRRSV诱导细胞因子IL-10  22      3.3.3 PRRSV GP5上诱骗表位(decoy epitop)及糖基化位点对体液免疫的影响  22-23      3.3.4 PRRSV干扰正常的抗原呈递  23-25  参考文献  25-33第二章 猪TNF-A基因原核表达与单克隆抗体的制备  33-53  摘要  33  1 材料与方法  33-45    1.1 材料与试剂  33-34    1.2 TNF-αA成熟蛋白编码基因的PCR扩增与原核表达质粒的构建  34-38      1.2.1 引物设计  34      1.2.2 RT-PCR扩增目的片段  34-35      1.2.3 PCR产物回收纯化  35-36      1.2.4 重组质粒的构建  36-38    1.3 融合蛋白的表达,纯化及抗原性鉴定  38-42      1.3.1 转化感受态大肠杆菌BL-21  38      1.3.2 重组蛋白表达条件的优化  38      1.3.3 SDS-PAGE电泳分析  38-39      1.3.4 重组蛋白的大量表达  39-40      1.3.5 重组蛋白的亲和层析纯化  40-41      1.3.6 重组蛋白的抗原性鉴定  41-42    1.4 动物免疫  42    1.5 间接ELISA筛选方法的建立  42    1.6 单克隆抗体的制备  42-45      1.6.1 SP2/0骨髓瘤细胞的准备  42-43      1.6.2 饲养细胞的制备  43      1.6.3 脾淋巴细胞的准备与细胞融合  43-44      1.6.4 阳性杂交瘤细胞的亚克隆  44      1.6.5 腹水的制备  44      1.6.6 阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏  44-45    1.7 单克隆抗体特性的鉴定  45      1.7.1 Western blotting鉴定  45      1.7.2 Ig型鉴定  45      1.7.3 抗体分泌稳定性测定  45  2 结果  45-50    2.1 TNF-α基因的扩增  45-46    2.2 pET-28a-TNF-α原核表达质粒的构建  46    2.3 重组蛋白的表达、纯化与抗原性鉴定  46-47    2.4 杂交瘤细胞株的筛选  47-48    2.5 单抗的Ig亚型鉴定  48    2.6 单抗1E2和2F3的特异性鉴定  48-49    2.7 杂交瘤细胞株分泌单抗的稳定性鉴定  49-50  3 讨论  50-51  参考文献  51-52  ABSTRACT  52-53第三章 PRRSV不同毒株感染猪肺泡巨噬细胞TNF-A变化规律比较研究  53-67  摘要  53  1 材料与方法  53-54    1.1 主要试剂  53-54    1.2 肺泡巨噬细胞制备  54  2 猪肺泡巨噬细胞PRRSV感染后不同时间TNF-A检测  54-57    2.1 定量RT-PCR方法检测TNF-α mRNA  54-56      2.1.1 引物设计与合成  54-55      2.1.2 RNA提取  55      2.1.3 逆转录  55-56      2.1.4 Real Time PCR  56      2.1.5 数据分析  56    2.2 ELISA方法检测TNF  56-57  3 定量RT-PCR方法检测PRRSV N蛋白MRNA  57-59    3.1 引物设计与合成  57    3.2 RNA提取  57-58    3.3 逆转录  58    3.4 Real Time PCR  58-59    3.6 数据分析  59  4 结果  59-62    4.1 PRRSV在PAM细胞上增殖定量检测  59    4.2 TNF-α mRNA定量检测标准曲线绘制  59-60    4.3 荧光实时定量PCR检测TNF-α mRNA  60-61    4.4 ELISA方法检测TNF-α标准样品曲线  61    4.5 ELISA方法检测TNF-α  61-62  5 讨论  62-64  参考文献  64-66  ABSTRACT  66-67全文总结  67-69致谢  69-71附录  71-76

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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