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蛋白酶抑制剂的制备及其抑制狭鳕鱼糜凝胶劣化的研究

作　者: 李德昆
导　师: 林洪
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工与贮藏工程
关键词: 蛋白酶抑制剂基因重组纯化鱼糜凝胶劣化
分类号: TS254
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

鱼糜是一种经粉碎和漂洗后,主要由可溶性肌原纤维蛋白组成的鱼肉制品。鱼糜中残留的蛋白酶可引起鱼糜凝胶结构的破坏,从而导致鱼糜制品品质及商业价值的下降。蛋白酶抑制剂可用于抑制鱼糜凝胶的降解。本研究选取鲑鱼的卵和血浆作为原材料以提取蛋白酶抑制剂。通过酸处理、超滤浓缩和木瓜蛋白酶亲和柱纯化,从鲑鱼卵中纯化出了一种cystatin,其纯化回收率、比活力和纯化倍数分别为0.4%、1.54 U/mg和192.6倍。SDS-PAGE检测发现其分子量为13 kDa。氨基酸测序发现其N-末端为N-Gly-Leu-Ile-Gly-Gly-Pro-Met-Asp-Ala-Asn-C,该序列与鲑鱼其它组织中的cystatin的组成完全一致。通过使用木瓜蛋白酶亲和柱,从鲑鱼血浆中纯化出了一种kiniongen,该纯化的回收率、比活力和纯化倍数分别为0.94%、3.84 U/mg和30.36倍。SDS-PAGE与FPLC的检测表明其分子量为70 kDa。抑制活性染色表明,该抑制剂仅在非还原条件下可检出。PAS染色表明该抑制剂属于糖蛋白。以木瓜蛋白酶作为目标酶,鲑鱼卵cystatin的抑制能力最强;鲑鱼血浆kiniongen的抑制能力高于玻璃鱼卵抑制剂I、池沼公鱼抑制剂和另一种鲑鱼卵抑制剂;以组织蛋白酶L作为目标酶,鲑鱼卵cystatin的抑制能力略低于玻璃鱼卵抑制剂II,高于其他抑制剂;鲑鱼血浆kininogen的抑制能力高于狭鳕卵抑制剂、玻璃鱼卵抑制剂I和鲑鱼卵抑制剂。鲑鱼卵cystatin和鲑鱼血浆kininogen具有广范围的酸碱和热稳定性。在pH 5–8的范围内,鲑鱼卵cystaitn的活性几乎无损失。在pH 6–9的范围内,鲑鱼血浆kininogen可保留60%以上的抑制活力。鲑鱼卵cystatin在70°C以下处理30 min,可保留大于50%的活性。鲑鱼血浆kininogen在60°C处理30 min,可保留50%的活性。鲑鱼卵cystatin与鲑鱼血浆kininogen主要在20–50°C的范围内表现出抑制活性。Dixon-plot作图发现,鲑鱼卵cystatin属于竞争性抑制剂,其抑制常数为2.12 nM;鲑鱼血浆kininogen属于非竞争性抑制剂,其抑制常数为105.32 nM。通过合成编码鲑鱼卵cystatin的DNA,采用pYES2NT/C质粒,以啤酒酵母YPH 499为宿主,进行了鲑鱼卵cystatin的重组表达。诱导表达后,分别使用选择性镍亲和柱和乙醇沉淀法进行重组cystatin的纯化,其中亲和纯化的回收率、比活力和纯化倍数分别为61.23%、7.45 U/mg和5.60倍。SDS-PAGE检测发现,重组cystatin的分子量为35 kDa,推测其发生了双体交联。与天然鲑鱼卵cystatin相比,重组cystatin的抑制活力有所下降,在酸性范围内的稳定性也有所下降,但其热稳定性得以增强。采用响应面法进行了摇瓶规模啤酒酵母YPH 499生产重组cystatin的优化研究,发现在培养基pH为5.7,诱导时间为6.7 h,诱导辅助剂的添加量为5.6 g/L时,重组cystatin的产量最大,可达0.57 U/mL。该研究结果与重复实验结果相一致。在摇瓶优化研究的基础上,进行了发酵罐中搅动速率和通气速率影响啤酒酵母YPH 499生产重组cystatin的优化研究,发现在350 rpm的搅动速率结合1.0 vvm的通气速率的发酵条件下,发酵罐中重组cystatin产量达到最大,为0.56 U/mL。该研究结果与重复实验结果相一致。将纯化的重组cystatin添加到狭鳕鱼糜中,进行了鱼糜凝胶劣化的抑制研究。亲和纯化的重组cystatin,添加量为100μg/g时,其对鱼糜凝胶劣化的抑制率可达到90%以上。在该添加剂量下,凝胶的破碎力和变形量分别增加了4.5倍和30%。同时,其可榨出水分含量由17.85%减至6.27%,白度由49.78增加至52.60。SDS-PAGE检测表明,通过添加重组cystatin,可显著抑制蛋白酶引起的肌球蛋白的降解。重组cystatin的抑制效果显著强于蛋清粉。醇沉纯化的重组cystatin也可有效抑制鱼糜凝胶劣化,通过添加500μg/g的醇沉重组cystatin,可使凝胶的破碎力和变形量增加2.7倍和10%。因此,可将重组cystatin用于抑制狭鳕鱼糜的凝胶劣化。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-14
前言  14-32
  1.鱼糜资源  15-17
  2. 鱼糜的凝胶过程  17-19
  3. 鱼糜中的酶类  19-25
  4. 鱼糜凝胶劣化的控制  25-32
第一章蛋白酶抑制剂的筛选  32-54
  1. 材料  32-33
  2. 方法  33-37
    2.1 粗血浆蛋白的制备  33
    2.2 溴化氢–木瓜蛋白酶–琼脂糖凝胶48 亲和介质的制备  33
    2.3 蛋白酶抑制剂的纯化  33-34
      2.3.1 鲑鱼卵中cystatin 的纯化  33-34
      2.3.2 鲑鱼血浆中kininogen 的纯化  34
    2.4 蛋白酶抑制活性的检测  34-35
      2.4.1 半胱氨酸蛋白酶抑制活性的检测  34-35
        2.4.1.1 木瓜蛋白酶抑制活性的检测  34-35
        2.4.1.2 组织蛋白酶L 抑制活性的检测  35
      2.4.2 丝氨酸蛋白酶抑制活性的检测  35
    2.5 电泳  35-36
      2.5.1.5 DS–PAGE  35-36
      2.5.2 抑制活性染色  36
      2.5.3.P AS-染色  36
    2.6. FPLC  36
    2.7 抑制剂的酸碱稳定性、热稳定性和活性  36-37
    2.8 蛋白质浓度  37
    2.9 抑制常数  37
    2.10. N -端氨基酸测序  37
  3. 结果与讨论  37-54
    3.1 半胱氨酸蛋白酶抑制剂的纯化  37-41
      3.1.1 鲑鱼卵中抑制剂的纯化  37-39
      3.1.2 鲑鱼血浆中抑制剂的纯化  39-41
    3.2 电泳  41-46
      3.2.1 鲑鱼卵抑制剂的纯度与分子量  41-42
      3.2.2 鲑鱼血浆抑制剂的电泳结果  42-46
        3.2.2.1 鲑鱼血浆的抑制活性染色  42-43
        3.2.2.2 鲑鱼血浆抑制剂的纯度与分子量  43-45
        3.2.2.3 鲑鱼血浆抑制剂的PAS-染色  45-46
    3.3 抑制剂的抑制活性比较  46-47
    3.4 抑制剂的酸碱稳定性与热稳定性和热活性  47-50
      3.4.1 抑制剂的酸碱稳定性  47-48
      3.4.2 抑制剂的热稳定性  48-50
      3.4.3 抑制剂的热活性  50
    3.5 抑制剂的抑制类型及抑制常数  50-53
      3.5.1 鲑鱼卵cyatatin  50-51
      3.5.2 鲑鱼血浆kininogen  51-52
      3.5.3 抑制常数的比较  52-53
    3.6.N -端氨基酸测序  53
    3.7 小结  53-54
第二章鲑鱼卵cystatin 的重组表达及其发酵生产条件优化  54-86
  1. 材料  54-55
  2. 方法  55-60
    2.1 鲑鱼卵cystatin 编码DNA 的合成  55
    2.2 鲑鱼卵cystatin 编码DNA 在啤酒酵母中的转化  55-56
    2.3 重组质粒的稳定性  56
    2.4 重组菌株的培养及重组cystatin 的诱导表达  56-57
    2.5.R C 的检测  57
    2.6.R C 的纯化  57-58
      2.6.1 亲和纯化  57
      2.6.2 乙醇沉淀纯化  57-58
    2.7.RC 的性质研究  58
      2.7.1 抑制活性  58
      2.7.2 酸碱稳定性  58
      2.7.3 热稳定性  58
    2.8.R C 发酵生产的优化  58-59
      2.8.1 摇瓶规模RC 生产的优化  58
      2.8.2 发酵罐中RC 生产的优化  58-59
      2.8.3 验证实验  59
    2.9 检测分析  59
      2.9.1 微生物浓度  59
      2.9.2 溶氧检测  59
      2.9.3 葡萄糖和半乳糖含量检测  59
    2.10 数据分析  59-60
  3. 结果与讨论  60-86
    3.1 重组用微生物的选择  60
    3.2 鲑鱼卵cystatin 编码DNA  60-61
    3.3 鲑鱼卵cystatin 的质粒转化及验证  61-63
    3.4 重组质粒的稳定性  63-64
    3.5 重组菌株的培养及RC 的诱导表达  64-65
    3.6.RC 的纯化  65-68
      3.6.1 亲和纯化RC  65-67
      3.6.2 乙醇沉淀纯化RC  67-68
    3.7.RC 的性质研究  68-70
      3.7.1 抑制活性的比较  68
      3.7.2 酸碱稳定性的比较  68-69
      3.7.3 热稳定性的比较  69-70
    3.8.RC 的生产优化  70-85
      3.8.1 摇瓶培养的优化  70-76
        3.8.1.1 星点设计  70-73
        3.8.1.2 培养基pH、诱导时间和诱导辅助剂的添加量对RC 产量的影响  73-75
        3.8.1.3 最佳培养条件的预测  75-76
        3.8.1.4 摇瓶培养优化验证  76
      3.8.2 发酵罐培养的优化  76-85
        3.8.2.1 搅动速率的影响  77-81
        3.8.2.2 通气速率的影响  81-84
        3.8.2.3 发酵罐培养优化验证  84-85
    3.9 小结  85-86
第三章利用 RC 抑制狭鳕鱼糜凝胶劣化的研究  86-98
  1. 材料  86
  2. 方法  86-88
    2.1.R C 对鱼糜降解的抑制能力  86-87
    2.2 鱼糜凝胶的制备  87
    2.3 凝胶结构分析  87
    2.4 凝胶白度检测  87
    2.5 可榨出水分检测  87-88
    2.6 鱼糜凝胶中蛋白质溶解度的测定  88
    2.7 蛋白质图谱  88
    2.8 数据分析  88
  3. 结果与讨论  88-98
    3.1 亲和纯化的RC 对鱼糜凝胶劣化的抑制作用  88-94
      3.1.1.R C 对狭鳕鱼糜降解的抑制作用  88-89
      3.1.2.R C 对鱼糜凝胶结构的作用  89-91
      3.1.3.R C 对鱼糜凝胶可榨出水分含量和白度的影响  91-92
      3.1.4.R C 对鱼糜凝胶蛋白质溶解度的影响  92-93
      3.1.5.R C 对鱼糜凝胶蛋白质降解的影响  93-94
    3.2 乙醇沉淀纯化的RC 对鱼糜凝胶劣化的抑制作用  94-97
      3.2.1 粗RC 对鱼糜凝胶结构的作用  94-96
      3.2.2 粗RC 对鱼糜凝胶可榨出水分含量和白度的影响  96-97
    3.3 小结  97-98
第四章结论  98-99
论文创新点  99-100
后续工作计划  100-101
参考文献  101-107
个人简历  107
论文发表情况  107-108
致谢  108

蛋白酶抑制剂的制备及其抑制狭鳕鱼糜凝胶劣化的研究

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