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N-乙酰半胱氨酸对BDE-209诱导原代培养新生鼠海马神经元细胞的损伤影响及相关机制研究

作　者: 刘付春
导　师: 陈敦金
学　校: 广州医学院
专　业: 妇产科学
关键词: 海马神经细胞 十溴联苯醚 N-乙酰半胱氨酸 形态观察 细胞存活率 凋亡 P38MAPK ROS 钙超载
分类号: R722.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


【背景】1.关于多溴联苯醚(Polybrominated Diphenyl Ethers ,PBDEs)PBDEs是一系列含溴原子的芳香族化合物。根据苯环上溴原子的个数和位置的不同,多溴联苯醚总共有209种同分异构体。其最大的用途是作为阻燃剂,已被广泛用于电子电器设备、自动控制设备,建筑材料和纺织品等商品化产品。由于PBDEs环境中不易分解可形成持续性的有机污染物、并具有高亲脂性、生物累积及生物放大效应等特性。可通过食物、母乳及呼吸途径进入生物体内,对环境和人体造成巨大的潜伏性的危害。故有专家称之为“化学定时炸弹”。由PBDEs化学结构与早就臭名昭著的多氯联苯(PCB)及甲状腺激素相似,其实,自开始使用至今,PBDEs对人体健康的潜在不良因素影响一直受到研究者的关注;以往研究证实低溴PBDES可导致甲状腺素分泌紊乱、神经行为改变以及诱发恶性肿瘤,由于其亲脂\及化学结构与甲状腺激素的类似,其对生物毒性作用最受人关注的就是发育的神经毒性。研究者对发育神经毒性的关注依据主要来源于以下几个方面发现:1)孕期或产后的PBDEs暴露的动物实验,能够造成动物的长期行为改变,尤其是指运动活动及认知活动及记忆能力。2)PBDEs会影响甲状腺的内环境稳定,进而导致发育神经的毒性。3)研究表明年幼的动物对于PBDEs的排泄能力比成年的动物差,并且在年幼的动物体内(包括脑组织)检测的PBDEs浓度比成年的动物高。4)PBDEs能够通过乳汁排泄,在北美发现相当高的浓度。5)粉尘是PBDEs暴露的一个主要来源。因此,在美国以及欧洲等地,低溴类如BDE-47,99,153等相继被限制生产及使用。2.关于十溴联苯醚(Brominated Diphenyl Ethers-209 ,BDE-209)BDE-209为PBDEs的高溴类化合物,是一种含十个溴原子的高溴多溴联苯醚,由于其具有添加量少而热稳定性好,价格便宜等优势,目前应用最广泛。由于用量多\用途广,推测环境中浓度高\生物蓄积量大,BDE-209在生物体中的浓度还将继续升高。由于BDE-209的高亲脂性,易通过血脑屏障,有研究者认为BDE-209在围产期暴露可以导致仔鼠成年后的自发行为以及学习记忆能力的影响。研究也证明BDE-209具有神经发育毒性,免疫毒性,内分泌毒性以及致癌性等。但也有学者认为BDE-209在体内的代谢快,蓄积低,在常规暴露水平下对机体不造成影响。由于研究结果不一致,故研究BDE-209的生物毒性是很有必要的。3.关于N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)NAC可提高机体内的谷胱甘肽(glutathion, GSH)含量。NAC作为小分子物质,易于进入细胞,脱乙酰基后成为GSH合成的前体,促进GSH的合成,提高组织内GSH含量,增强组织的抗自由基及药物和毒物损伤能力。GSH是由谷氨酸,半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽,半胱氨酸上的巯基是其活性基团, GSH具有解毒、抗氧化等多种重要功能。体内和体外的实验证据均提示NAC能提高细胞内GSH的生物合成。NAC提高体内GSH含量的作用可以解释其在多种疾病过程中的保护作用。很多体内和体外的研究表明NAC能够抑制多种毒物的氧化应激作用,从而减轻细胞或组织的凋亡及损伤。我们前期实验结果已证实,孕哺期母鼠BDE-209暴露可导致仔鼠神经系统发育异常,出现学习与记忆力障碍,而对其机制的进一步研究提示可能与氧化应激反应增强、细胞凋亡增加有关。本研究将在前期研究基础上,本课题从细胞分子水平,用BDE-209对新生鼠海马神经元细胞进行染毒,并观察NAC减少其毒性作用,光镜观察神经元细胞的形态与突触发育情况,通过检测神经细胞存活率、细胞凋亡率、P38MAPK的表达、Ca2+含量、ROS氧化应激指标,初步探讨BDE-209的神经毒性作用机制及N-乙酰半胱氨酸的干预效果。本课题分为以下四个部分进行各项具体实验。第一部分N-乙酰半胱氨酸对BDE-209诱导原代培养新生鼠海马神经元细胞损伤的影响及相关机制研究【目的】取新生SD大鼠(一天内)的海马组织进行原代神经元细胞培养,鉴别神经元的纯度,观察BDE-209对原代培养新生鼠海马神经元细胞形态结构及细胞存活率的影响。【材料与方法】1.购买新生SD大鼠(一天内),取新生鼠海马组织进行原代神经元细胞培养。2.培养7天后海马神经元细胞进行神经元细胞纯度鉴别。3.原代培养7d的新生鼠海马神经细胞暴露于BDE-209,实验共分10组,即空白对照组、DMSO对照组、NAC对照组、NAC+DMSO对照组、实验A、B、C、D、E、F组(BDE-209 10 ug/ml、BDE-209 30 ug/ml、BDE-209 50.0 ug/ml、BDE-209 10 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 30 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 50.0 ug/ml +NAC 0.1 mmol/l)。每组设3个平行样。DMSO对照组加入含1‰DMSO的培养液,NAC对照组加入含0.1 mmol/l NAC的培养液。24h后,在倒置显微镜下进行细胞形态观察。4. MTT比色分析检测神经元的存活率。【结果】1.原代海马神经元细胞培养第7天观察神经元胞体清晰明亮,呈明显凸起状,周围晕光明显,胞核及核仁清晰可见,突起变粗变长并有分支,边缘清晰,形成明显的神经网络。2.免疫细胞化学法NeuN鉴定神经元的经典方法。由结果可见分散的海马神经元,神经元是主体,可占95%。3.倒置显微镜观察不同剂量组神经元细胞形态,实验组可见神经元细胞胞体变小,变形,细胞膜完整但出现发泡现象,随着BDE-209浓度加大,发泡现象明显,其神经突起出现缩短。高剂量实验B、C组可见神经细胞膜不完整,皱缩,空泡明显,大量细胞出现皱缩、变圆、脱落,突起缩短甚至消失。NAC干预组可使细胞发泡现象明显减少。4. MTT检测海马神经元细胞存活率:DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的细胞存活率分别为:99%、98%及92%,尚不能认为Blank control的细胞存活率与DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的细胞存活率有差别(P>0.05)。实验A、B、C组的细胞存活率分别为: 82%、54%、49%,Blank control的细胞存活率与实验A、B、C组(BDE-209 10 ,30, 50 ug/ml)的细胞存活率有差别(P<0.01),实验A组与实验B、C组比较(P<0.01),即随BDE-209浓度增加,细胞存活率有随之下降。加入0.1 mmol/l NAC的实验D、E、F组的细胞存活率分别为:82%、71%、68%,实验D组与实验A组比较(P>0.05),实验E组与实验B组比较(P<0.01),实验F组与实验C组比较(P<0.01),即同时加入0.1 mmol/l NAC能够减轻BDE-209导致的海马神经细胞的损伤。【结论】BDE-209(10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml)作用24小时,均可致培养7d的新生鼠海马神经细胞的损伤。观察到海马神经细胞及突触结构发生改变;随BDE-209浓度增加,细胞存活率有不同程度的下降。NAC(0.1mmol/l)同时作用24小时,可减轻细胞的损伤,提高细胞存活率。第二部分N-乙酰半胱氨酸对BDE-209诱导原代培养新生鼠海马神经元细胞的凋亡及P38MAPK的表达研究【目的】观察BDE-209染毒原代培养新生鼠海马神经元细胞的凋亡及P38MAPK的表达,以及NAC的干预效果。【材料与方法】1.原代培养7d的新生鼠海马神经细胞暴露于BDE-209,实验共分10组,即空白对照组、DMSO对照组、NAC对照组、NAC+DMSO对照组、实验A、B、C、D、E、F组(BDE-209 10 ug/ml、BDE-209 30 ug/ml、BDE-209 50.0 ug/ml、BDE-209 10 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 30 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 50.0 ug/ml +NAC 0.1 mmol/l)。每组设3个平行样。DMSO对照组加入含1‰DMSO的培养液,NAC对照组加入含0.1 mmol/l NAC的培养液。2.采用流式细胞术Annexin V/PI检测海马神经细胞凋亡。3.激光共聚焦扫描显微镜免疫荧光检测海马神经细胞凋亡P38MAPK的表达。【结果】1.流式细胞仪FITC-Annexin V/PI法检测BDE-209诱导海马神经细胞凋亡:Blank control海马神经细胞凋亡率2.35%。DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的细胞凋亡率分别为:2.58%、2.91%及3.70%,尚不能认为Blank control的细胞凋亡率与DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的细胞凋亡率有差别(P>0.05)。实验A、B、C组的细胞凋亡率分别为:8.28%、20.28%和29.81%,Blank control的细胞凋亡率与实验A、B、C组(BDE-209 10 ,30, 50 ug/ml)的细胞存活率有差别(P<0.01),实验A组与实验B、C组比较(P<0.01),实验B组与实验C组比较(P<0.01),即随BDE-209浓度增加,细胞凋亡率有随之升高。加入0.1 mmol/l NAC的实验D、E、F组的细胞凋亡率分别为:4.72%、7.71%、11.08%,实验D组与实验A组比较(P<0.01),实验E组与实验B组比较(P<0.01),实验F组与实验F组比较(P<0.01),即同时加入0.1 mmol/l NAC能够减轻BDE-209诱导海马神经细胞的凋亡。2.激光共聚焦扫描显微镜免疫荧光检测海马神经细胞凋亡P38MAPK的表达:免疫荧光和图像分析显示正常海马神经细胞胞浆P38MAPK弱表达,其荧光强度为: 1.38±0.31,DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的P38MAPK的表达荧光强度分别为:1.47、1.48及1.85,尚不能认为Blank control的P38MAPK的表达与DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的P38MAPK的表达有差别(P>0.05)。实验A、B、C组的P38MAPK的表达荧光强度分别为:3.20、6.07和8.71, Blank control的P38MAPK的表达与实验A、B、C组(BDE-209 10 ,30, 50 ug/ml)的P38MAPK的表达有差别(P<0.01),实验A组与实验B、C组比较(P<0.01),实验B组与实验C组比较(P<0.01),即随BDE-209浓度增加,P38MAPK表达上调。加入0.1 mmol/l NAC的实验D、E、F组的P38MAPK的表达分别为:2.88、3.01、3.57,实验D组与实验A组比较(P>0.05),实验E组与实验B组比较(P<0.01),实验F组与实验F组比较(P<0.01),即同时加入0.1 mmol/l NAC能够减轻BDE-209诱导海马神经细胞的P38MAPK的表达。【结论】BDE-209(10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml)作用24小时,均可致海马神经细胞的凋亡。BDE-209可通过影响调亡信号P-P38MAPK的表达,诱导海马神经元细胞调亡。NAC(0.1mmol/l)同时作用24小时,可抑制神经元细胞的P-P38MAPK的表达,减轻海马神经元细胞调亡。第三部分N-乙酰半胱氨酸对BDE-209诱导原代培养新生鼠海马神经元细胞ROS的研究【目的】观察BDE-209对原代培养新生鼠海马神经元细胞内活性氧族(Reactive Oxygen Species ,ROS)含量的影响,以及NAC的干预效果。【材料与方法】1.原代培养7d的新生鼠海马神经细胞暴露于BDE-209,实验共分10组,即空白对照组、DMSO对照组、NAC对照组、NAC+DMSO对照组、实验A、B、C、D、E、F组(BDE-209 10 ug/ml、BDE-209 30 ug/ml、BDE-209 50.0 ug/ml、BDE-209 10 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 30 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 50.0 ug/ml +NAC 0.1 mmol/l)。每组设3个平行样。DMSO对照组加入含1‰DMSO的培养液,NAC对照组加入含0.1 mmol/l NAC的培养液。2.激光共聚焦扫描显微镜免疫荧光检测海马神经细胞ROS荧光强度。【结果】激光共聚焦扫描显微镜免疫荧光检测海马神经细胞ROS的表达:免疫荧光和图像分析显示正常海马神经细胞ROS弱表达,其荧光强度为: 5.38,DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的ROS的表达荧光强度分别为:5.33、5.26及5.39,尚不能认为Blank control的ROS的表达与DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的ROS的表达有差别(P>0.05)。实验A、B、C组的ROS的表达分别为:15.27、18.96和24.53,Blank control的ROS的表达与实验A、B、C组(BDE-209 10 ,30, 50 ug/ml)的ROS的表达有差别(P<0.01),实验A组与实验B、C组比较(P<0.01),实验B组与实验C组比较(P<0.01),即随BDE-209浓度增加,ROS的表达随之升高。加入0.1 mmol/l NAC的实验D、E、F组的P38MAPK的表达分别为:5.44、5.42、7.29,尚不能认为Blank control的ROS的表达与实验D、E、F组的ROS的表达有差别(P>0.05),即同时加入0.1 mmol/l NAC能够减轻BDE-209诱导海马神经细胞的ROS的表达。【结论】BDE-209(10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml)作用24小时,均可使海马神经细胞的ROS水平升高,可致海马神经元细胞氧化应激损伤,这可能是BDE-209神经毒性的作用机制之一。NAC(0.1mmol/l)同时作用24小时,可以减轻海马神经元细胞氧化应激损伤。第四部分N-乙酰半胱氨酸对BDE-209诱导原代培养新生鼠海马神经元细胞钙超载的研究【目的】观察BDE-209对原代培养新生鼠海马神经元细胞内Ca2+超载,以及NAC的干预效果。【材料与方法】1.原代培养7d的新生鼠海马神经细胞暴露于BDE-209,实验共分10组,即空白对照组、DMSO对照组、NAC对照组、NAC+DMSO对照组、实验A、B、C、D、E、F组(BDE-209 10 ug/ml、BDE-209 30 ug/ml、BDE-209 50.0 ug/ml、BDE-209 10 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 30 ug/ml+NAC 0.1 mmol/l、BDE-209 50.0 ug/ml +NAC 0.1 mmol/l)。每组设3个平行样。DMSO对照组加入含1‰DMSO的培养液,NAC对照组加入含0.1 mmol/l NAC的培养液。2.流式细胞仪检测海马神经细胞Ca2+含量变化。【结果】流式细胞仪检测海马神经细胞Ca2+含量:正常海马神经细胞Ca2+含量为: 12.38, DMSO control、NAC control及NAC+DMSO control的Ca2+含量分别为:13.38、14.31及15.36,尚不能认为Blank control的Ca2+含量与DMSO control、NAC control、NAC+DMSO control的Ca2+含量有差别(P>0.05)。实验A、B、C组的Ca2+含量分别为:26.85、55.95及78.14, Blank control的Ca2+含量与实验A、B、C组(BDE-209 10 ,30, 50 ug/ml)的Ca2+含量有差别(P<0.01),实验A组与实验B、C组比较(P<0.01),实验B组与实验C组比较(P<0.01),即随BDE-209浓度增加,Ca2+含量随之升高。加入0.1 mmol/l NAC的实验D、E、F组的P38MAPK的表达分别为:17.28、23.53及28.10,实验D组与实验A组比较(P<0.01),实验E组与实验B组比较(P<0.01),实验F组与实验C组比较(P<0.01),即同时加入0.1 mmol/l NAC能够减轻BDE-209诱导海马神经细胞的钙超载。【结论】BDE-209(10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml)作用24小时,均可致海马神经元细胞钙超载,这可能是BDE-209神经毒性的作用机制之一。NAC(0.1mmol/l)同时作用24小时,可以减轻海马神经元细胞钙超载所致的损伤。

全文目录


中文摘要  3-11
ABSTRACT  11-20
前言  20-28
第一部分 N-乙酰半胱氨酸对BDE-209 诱导原代培养新生鼠海马神经元细胞损伤形态学的影响  28-40
  材料与方法  28-33
  结果  33-38
  讨论  38-40
第二部分 N-乙酰半胱氨酸对BDE-209 诱导原代培养新生鼠海马神经元细胞的凋亡及 P38MAPK 的表达研究  40-52
  材料与方法  40-43
  结果  43-48
  讨论  48-52
第三部分 N-乙酰半胱氨酸对BDE-209 诱导原代培养新生鼠海马神经元细胞ROS 的研究  52-61
  材料与方法  52-55
  结果  55-58
  讨论  58-61
第四部分 N-乙酰半胱氨酸对 BDE-209 诱导原代培养新生鼠海马神经元细胞钙超载的研究  61-67
  材料与方法  61-63
  结果  63-65
  讨论  65-67
参考文献  67-79
小结  79-80
缩略词表  80-81
综述  81-111
研究生在读期发表文章  111-112
致谢  112-113

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